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目的:本研究通过验证microRNA-744在结直肠癌中的生物学特性,观察其与胃泌素刺激结直肠癌细胞株SW480增殖的之间的关系,旨在进一步明确胃泌素与microRNA-744在协同参与结直肠癌的发生发展中可能存在的调控作用及分子机制,不仅为结直肠肿瘤患者的早期分子诊断及个性化治疗提供可靠的理论基础,而且还为结直肠癌的临床诊治及防治工作提供了隐匿的靶点及实验依据。方法:1、miR-744在结直肠癌中的生物学特性的研究(1)miR-744在结直肠癌组织及细胞中的表达检测本研究采用real-time RT-PCR方法检测结直肠癌组织、非癌组织以及细胞中miR-744的表达情况。(2)miR-744对结直肠癌细胞体外生物学特点的影响检测miR-744对体外结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。(3)miR-744下游靶基因的预测与验证利用生物信息学在线数据库TargetScan、miRanda及microRNA.org对miR-744的靶基因进行初步预测及筛选,结合相关文献中双荧光素酶报告并采用实时荧光定量PCR与WB(Western Blot)等技术进行验证。2、MicroRNA-744/Notch1信号通路在胃泌素促进细胞增殖中的作用研究(1)采用real-time RT-PCR方法检测用不同浓度梯度的五肽胃泌素(6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L)作用24h的结直肠癌细胞株SW480中miR-744的表达情况,并运用Western Blot技术检测miR-744的靶基因Notch1蛋白水平变化。(2)实验分组情况:I组:空白对照组,加入含10%胎牛血清培养基RPMI-1640。II组:阴性转染组,将microRNA mimic Negative Control瞬时转染至细胞,24h后换10%胎牛血清培养基RPMI-1640继续培养。III组:胃泌素组,加入含五肽胃泌素(25mg/L)的10%胎牛血清培养基RPMI-1640。IV组:转染miR-744 mimic干扰组,将miR-744 mimic瞬时转染至细胞,24h后10%胎牛血清培养基RPMI-1640继续培养。各组miR-744的表达丰度可通过real-time RT-PCR技术检测来确定。用CCK-8方法检测各组细胞增殖能力变化情况。接着用Western Blot方法验证各组靶基因的蛋白水平是否发生相应的变化。本研究采用统计软件SSPS22.0进行统计和分析,计量资料用均数±标准差((?)±S)形式表示,采用方差分析和SNK-q检验对比多组间的差异水平,P<0.05被认为具有统计学差异。结果:1、miR-744在结直肠癌组织中及细胞系中表达降低。对SW480细胞进行过表达miR-744后,细胞增殖能力、迁移能力以及侵袭能力均明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率大于阴性对照组,且具有统计学差异(P<0.05)。而阴性转染组与空白对照组差别无统计学意义(P>0.05)。2、利用生物信息学技术,结合目前使用较为广泛的在线数据库TargetScan(www.targetscan.org)、miRanda(www.microRNA.org)及microRNA.org等对miR-744的潜在靶点进行预测,预测Notch1为miR-744的靶基因。结合相关文献中双荧光素酶报告基因检测结果,初步发现Notch1的3’UTR区域存在与miR-744的5’端发生结合的结构序列,Notch1的表达可能受到miR-744的直接调控。miR-744过表达的SW480细胞中Notch1的mRNA和蛋白水平均明显降低。3、胃泌素浓度在6.25~100mg/L范围内对结直肠癌细胞SW480中的miR-744表达均具有下调作用,且浓度在25mg/L对其作用最强。Western Blot结果显示靶基因Notch1的蛋白表达量增加,胃泌素浓度在25mg/L时表达量最高。4、转染miR-744 mimic干扰组(IV组)细胞增殖能力明显小于阴性转染组(II组)及空白对照组(I组)(P<0.05);胃泌素组(III组)细胞增殖能力高于阴性转染组(II组)及空白对照组(I组)(P<0.05);胃泌素组(III组)细胞增殖能力显著大于转染miR-744 mimic干扰组(IV组)(P<0.01);而空白对照组(I组)和阴性转染组(II组)增殖能力的对比无明显差别(P>0.05)。PCR结果提示转染miR-744mimic干扰组(IV组)miR-744表达水平明显高于其他三组(P<0.05),而胃泌素组(III组)的miR-744表达水平显著低于另外三组(P<0.05);而WB结果中各组细胞Notch1的表达量变化与PCR结果正好相反,且差异具有统计学意义(P<0.05)。但阴性转染组(II组)及空白对照组(I组)的PCR结果与WB结果并无明显差异(P>0.05)。结论:1、microRNA-744在结直肠癌中的表达量降低;2、microRNA-744在结直肠癌中作为抑癌因子,可能通过抑制Notch1癌基因表达发挥了抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的功能。3、microRNA-744/Notch1信号通路在胃泌素促进结直肠癌细胞增殖的过程中发挥了调控作用。