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目的:作为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族的两个重要成员,survivin和X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）在包括结直肠癌在内的众多肿瘤组织中显著高表达,参与了肿瘤发生发展的众多生物学过程,一直被认为是肿瘤治疗的潜在靶标。既往研究报道,survivin可以与XIAP形成IAP-IAP复合物,使XIAP稳定,进而协同抑制Caspase 9的活性、发挥抗凋亡作用。因此,本研究旨在开发一种全新的靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽并探索其在结直肠癌细胞中的抗肿瘤机制。研究方法:1、利用在线数据库Oncomine和GEPIA分析IAPs在包括结直肠癌在内的多种肿瘤组织及正常组织中的表达;2、设计并合成靶向survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X,Con作为阴性对照;3、免疫共沉淀法检测结直肠癌细胞中survivinXIAP复合物的形成以及Sur-X对survivin和XIAP结合的影响;4、利用MTT法、集落形成实验检测Sur-X对结直肠癌细胞生长的影响;5、建立裸鼠皮下异种移植瘤模型,检测Sur-X的体内抗肿瘤活性及安全性;6、利用实时凋亡、Caspase 3活性检测技术检测经Sur-X处理后结直肠癌细胞中发生凋亡的情况;7、利用Western blot检测SurX对凋亡相关蛋白表达水平的影响;8、利用qRT-PCR技术检测survivin和XIAP的mRNA表达水平;9、Cycloheximide（CHX）测定蛋白质半衰期,观察Sur-X对survivin和XIAP降解速度的影响;10、免疫共沉淀法检测Sur-X对XIAP与Caspase 9结合的影响;11、吉姆萨染色、实时坏死、Annexin V/7-AAD双染检测Sur-X对细胞膜完整性的影响;12、利用Western blot检测Sur-X对程序性坏死相关蛋白表达水平的影响;13、分别用z-VAD和Nec-1s预处理结直肠癌细胞,结合流式Annexin V/7-AAD双染,以确认Sur-X诱导结直肠癌发生凋亡和程序性坏死的情况;14、利用分子动力模拟预测Sur-X与XIAP的结合情况;15、利用PDB数据库查找与XIAP结合的蛋白;16、免疫共沉淀法检测结直肠癌细胞中XIAP-TAB1-TAK1复合物的形成以及Sur-X对XIAP与TAB1结合的影响;17、利用Western blot检测Sur-X对TAB1、TAK1、p-TAK1表达的影响;18、CHX测定蛋白质半衰期,观察Sur-X对TAK1降解速度的影响;19、利用Jet介导的siRNA或质粒转染,敲减TAK1、过表达TAB1;20、利用Western blot检测Sur-X对NF-κB通路的影响;21、利用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测Sur-X对结直肠癌细胞分泌TNF-α的影响;22、利用免疫组织化学染色分析裸鼠肿瘤组织中survivin、XIAP和MLKL的表达水平;23、利用TUNEL染色检测裸鼠体内肿瘤细胞凋亡的情况。结果:1、Survivin、XIAP在结直肠癌组织中高表达。Oncomine分析结果显示:survivin是IAP家族最为广泛研究的成员;GEPIA分析结果显示:与正常组织相比,所有IAPs中只有survivin和XIAP在结直肠癌组织中高表达。2、设计靶向结直肠癌细胞中survivin-XIAP复合物的抗肿瘤多肽Sur-X。免疫共沉淀结果显示,结直肠癌细胞HCT116和RKO中存在survivin-XIAP复合物;基于既往研究报道的survivin上能够与XIAP结合的最小片段为K15-M38,我们设计并合成了多肽Sur-X;HCT116细胞经SurX处理1小时后,分别用survivin抗体和XIAP抗体进行互逆免疫共沉淀,结果显示:survivin和XIAP的结合显著减少。3、Sur-X可特异、有效地抑制结直肠癌细胞生长。用一系列浓度Sur-X和Con（阴性对照）分别处理四种人结直肠癌细胞HCT116、RKO、HCT15和HT29以及一种人正常腹膜间皮细胞HMrSV5（SV5）,用MTT法检测细胞活力,结果显示:Sur-X能够显著抑制结直肠癌细胞的活力而对正常细胞SV5没有影响;集落形成实验结果也证实:Sur-X能够明显抑制结直肠癌细胞的生长;Western blot结果显示:survivin和XIAP在四种结直肠癌细胞系中均高表达,但在正常细胞SV5中不表达,提示Sur-X的特异性抗肿瘤作用可能依赖survivn和XIAP的表达。4、Sur-X能够显著抑制裸鼠体内结直肠癌细胞的生长且无明显毒性。为研究多肽Sur-X在体内的抗肿瘤活性,我们首先利用HCT116细胞建立了裸鼠皮下移植瘤模型并采用瘤内注射的给药方式,结果显示:Sur-X能够显著抑制肿瘤的生长且对裸鼠体重没有明显的影响;为进一步确认Sur-X在体内的有效性和安全性,我们对建立的裸鼠皮下移植瘤模型采用了静脉给药的方式,结果显示:Sur-X在静脉给药的情况下亦能够显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长,并且对重要脏器没有明显的毒性。5、Sur-X通过靶向survivin-XIAP复合物、促进survivin和XIAP降解,诱导结直肠癌细胞发生凋亡。实时凋亡检测、Caspase 3活性检测结果显示:Sur-X能够快速诱导结直肠癌细胞发生凋亡、增加Caspase 3活性;Western blot结果显示:Sur-X能够降低survivin和XIAP在HCT116和RKO中的表达,使Caspase 9、Caspase 3、Caspase 7以及PARP的裂解带增加;qRTPCR结果显示:Sur-X对survivin、XIAP的mRNA表达没有明显的抑制作用;CHX测蛋白质半衰期结果显示:Sur-X能够显著加速survivin和XIAP的降解;免疫共沉淀结果显示:Sur-X不影响XIAP与Caspase 9之间的相互作用;Annexin V/7-AAD流式双染结果显示:z-VAD仅能部分逆转Sur-X诱导的结直肠癌细胞死亡。6、Sur-X通过抑制XIAP与TAB1的结合,导致TAK1降解增加,促进结直肠癌细胞中程序性坏死的发生。吉姆萨染色、实时坏死检测以及Annexin V/7-AAD流式双染结果显示:Sur-X能够使结直肠癌细胞快速丧失细胞膜完整性;Western blot结果显示:经Sur-X处理后,结直肠癌细胞HCT116和RKO中p-RIP1,p-RIP3和p-MLKL的表达显著增加;Annexin V/7-AAD流式双染结果显示:程序性坏死抑制剂Nec-1s可部分逆转Sur-X导致的结直肠癌细胞死亡,尤以7-AAD阳性细胞的百分比降低为主;分子动力模拟预测Sur-X与XIAP结合的结果显示:Sur-X主要结合到XIAP的BIR1结构域;PDB数据库的检索结果显示:TAB1能够与XIAP的BIR1结构域结合;免疫共沉淀结果显示:结直肠癌细胞中存在XIAP-TBA1-TAK1复合体,且Sur-X能够干扰XIAP与TAB1的结合;Western blot结果显示:Sur-X能够显著降低TAK1、p-TAK1在结直肠癌细胞中的表达,但对TAB1的表达无明显影响;CHX测蛋白质半衰期结果显示:Sur-X能够加速TAK1降解;为验证TAB1和TAK1的表达如何影响结直肠癌细胞对Sur-X诱导的程序性坏死的敏感性,我们利用质粒和siRNA分别对TAB1和TAK1实施了过表达和敲减,并利用MTT法检测Sur-X对转染后的细胞活力的影响、利用Western blot检测程序性坏死相关指标的变化,结果显示:敲减TAK1增强了Sur-X对结直肠癌细胞的抑制作用,p-RIP1和p-MLKL的表达也有所增加,过表达TAB1则减弱了Sur-X对结直肠癌细胞的抑制作用,p-MLKL的表达也有所下调,而敲减TAK1可恢复过表达TAB1的结直肠癌细胞对Sur-X诱导的程序性坏死的敏感性;Western blot结果显示:Sur-X仅引起NF-κB通路短暂激活;ELISA结果显示:经Sur-X处理30分钟时,HCT116细胞上清中TNF-α含量最高。7、Sur-X在裸鼠体内同时诱导结直肠癌细胞发生凋亡和程序性坏死。利用HE、免疫组织化学染色以及TUNEL染色对接受静脉给药的裸鼠体内肿瘤细胞的凋亡和程序性坏死相关指标进行分析,结果显示:与Con组相比,Sur-X组肿瘤组织中survivin、XIAP表达较低,TUNEL染色明显较强;Sur-X组肿瘤组织中可见广泛的坏死区域,且MLKL表达显著低于Con组。结论:1、多肽Sur-X能够抑制结直肠癌细胞中survivin-XIAP复合物的形成;2、Sur-X在体内外均能特异、有效地抑制结直肠癌细胞生长;3、Sur-X通过干扰srvivin-XIAP复合物的形成、导致survivin和XIAP降解加速,进而促进结直肠癌细胞凋亡;4、Sur-X通过抑制XIAP与TAB1的结合、导致TAK1降解加速,进而诱导结直肠癌细胞发生程序性坏死;5、Sur-X通过同时诱导结直肠癌细胞发生凋亡和程序性坏死发挥抗肿瘤作用。