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胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,近年来,其发病率有逐年上升的趋势,由于胆管癌特殊的解剖部位和生物学特性,手术切除率低,对放化疗不敏感,治疗效果不佳,预后差,其生物学行为尚未完全掌握。随着对胆管癌的研究不断深入,人们开始从基因水平探索其治疗方案。趋化因子12的受体CXCR4(Leukocyte-expressedseven-trans-membrance domain receptor,LESTR)在很多恶性肿瘤中发挥作用,抑制肿瘤细胞表面的CXCR4基因,可以抑制肿瘤的生长与转移。本实验采用免疫组化SP法证实胆管癌组织中CXCR4蛋白呈高表达,评价了CXCR4表达在胆管癌的发生及预后中可能有的作用:并通过应用CXCR4基因抑制剂LPS(Lipopolysaccharide脂多糖)特异性的抑制胆管癌细胞株QBC939表面的CXCR4基因的表达,观察抑制CXCR4表达后QBC939细胞的生物学行为的变化,并观察了LPS抑制胆管癌细胞株QBC939表面的CXCR4后化疗药物氟尿嘧啶(5-Fu)对胆管癌细胞株QBC939生长和凋亡的影响及LPS对裸鼠移植胆管癌生长的抑制,为胆管癌的基因治疗提供实验依据。第一章CXCR4在胆管癌中的表达及其临床意义目的:检测正常胆管和胆管癌组织中趋化因子受体CXCR4的表达,分析CXCR4蛋白表达与临床病理特征、预后的关系,探讨CXCR4的表达在胆管癌发生、发展中的作用,评价其在胆管癌预后判断中的价值。方法:免疫组化SP法检测42例胆管癌和10例正常胆管石蜡切片标本中CXCR4蛋白的表达,SPSS13.0统计软件分析其表达与胆管癌临床病理参数和术后生存时间的关系。结果:正常胆管中无CXCR4蛋白的表达,胆管癌组织中CXCR4蛋白的表达率:为52.4%(22/42),有淋巴结转移的胆管癌中CXCR4蛋白的表达率为85.0%,显著高于无转移组的22.7%(P＜0.05),有远处转移的胆管癌中CXCR4蛋白的表达率为80.0%,显著高于无转移组的37.0%(p＜0.05)。统计学分析显示CXCR4蛋白的表达与肿瘤转移有关,与肿瘤复发时间及存活时间有关,与其他临床病理特征无关。结论:CXCR4在胆管癌组织中呈高表达:CXCR4可以作为判断胆管癌恶性程度及预后的指标之一。第二章LPS对胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响目的:检测胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白的表达,观察CXCR4抑制剂LPS对人胆管癌细胞株QBC939中CXCR4 mRNA及CXCR4蛋白表达的影响,及对胆管癌细胞株QBC939生长、凋亡和转移能力的影响,探讨以CXCR4基因为靶的胆管癌基因治疗的可行性。方法:①常规培养胆管癌细胞株QBC939:②免疫细胞化学SP法检测胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白的表达:③RT-PCR及Westernblot法检测胆管癌细胞株QBC939中CXCR4 mRNA和蛋白的表达及不同浓度LPS干预后CXCR4 mRNA和蛋白表达的变化;④采用MTT法检测LPS对胆管癌细胞株QBC939生长的抑制作用:⑤采用平板克隆形成实验检测LPS对胆管癌细胞株QBC939克隆形成的抑制作用;⑥流式细胞仪检测LPS对胆管癌细胞株QBC939凋亡的影响;⑦趋化试验检测LPS对胆管癌细胞株QBC939趋化能力的影响。结果:①胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白呈阳性表达:②QBC939细胞中有CXCR4 mRNA及蛋白的表达,不同浓度的LPS能不同程度抑制QBC939细胞中CXCR4 mRNA及蛋白的表达,LPS浓度为0.1ug/ml时,无明显影响(p＞0.05),为1.0ug/ml、5.0ug/ml时,CXCR4 mRNA及蛋白的表达均低于对照组(p＜0.05);③不同浓度的LPS对胆管癌细胞株QBC939增殖影响不同,24小时内,各浓度LPS对细胞增殖无明显抑制,LPS浓度为0.1ug/ml时,48小时内无明显影响,为1.0ug/ml、5.0ug/ml时,QBC939细胞生长受到明显抑制,72小时各浓度LPS对细胞的增殖均有明显抑制作用;④平板克隆形成试验显示对照组细胞培养第10天即可见明显克隆体形成,至第14天时克隆体数目多、体积大。而试验组细胞于培养第12天时才出现克隆体,且克隆体数目少、体积小;⑤不同浓度LPS可不同程度的诱导QBC939细胞凋亡,各浓度LPS组细胞凋亡率明显高于对照组(P＜0.05),以1.0ug/ml、5.0ug/ml浓度LPS对凋亡的诱导最明显(P＜0.05)⑥CXCL12(SDF-1)对QBC939细胞有明显的趋化作用,对照组细胞趋化率为53.723±1.812%,各浓度LPS组细胞趋化率明显低于对照组(P＜0.05)。结论:胆管癌细胞株QBC939中CXCR4蛋白呈阳性表达:LPS能封闭人胆管癌细胞株QBC939的CXCR4基因,有效降低其CXCR4 mRNA及蛋白的表达;CXCR4抑制剂LPS能抑制胆管癌细胞株QBC939的生长与转移能力,诱导细胞凋亡,CXCR4可能成为胆管癌基因治疗的靶点之一。第三章LPS对5-Fu杀伤QBC939细胞及诱导凋亡的影响及LPS治疗人胆管癌裸鼠移植瘤的实验研究目的:探讨LPS联合化疗药物5-FU对人胆管癌细胞株QBC939生长和诱导细胞凋亡的影响及LPS对裸鼠移植胆管癌生长的影响。方法:①四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测LPS对5-Fu杀伤QBc939细胞的影响:②流式细胞术观察LPS对5-FU诱导QBc939细胞凋亡的影响:③制作裸鼠移植胆管癌模型;④LPS局部注射治疗裸鼠移植胆管癌;⑤处死裸鼠后,WesterB blot法检测胆实验组和对照组肿瘤的CXCR4蛋白表达;⑥流式细胞仪检测实验组和对照组肿瘤的细胞凋亡率。结果:①MTT法检测显示5-Fu对胆管癌细胞株QBC939具有一定的杀伤作用,但易出现耐药性,LPS可以增强5-Fu对胆管癌细胞株QBC939的杀伤作用,并可能在一定程度上防止耐药的出现:②流式细胞术结果显示化疗药物5-Fu能显著诱导QBC939细胞发生凋亡,5-Fu组凋亡率为11.342±1.741%(P＜0.05),(对照组为3.471±0.192%),但加用LPS后,能更明显的诱导QBC939细胞凋亡,凋亡率达到26.443±2.292%,与单用化疗药物5-Fu比较,差异有显著性意义(P＜0.05);③对照组全部接种部位均有移植瘤生成,且肿瘤体积大,成瘤率为100%(8/8)试验组成瘤率为87.5%(7/8),移植瘤生长缓慢,瘤体小;④移植瘤在裸鼠皮下的生长与瘤重的变化:经过28天的治疗,试验组移植瘤的生长速度明显低于对照组,对照组于接种细胞后12天触及肿瘤,而试验组平均为15天,且生长较慢,试验组与对照组比较,肿瘤生长受到抑制,差异有显著性意义(P＜0.05);⑤Western-blot法检测发现,实验组CXCR4蛋白表达明显减弱;⑥LPS治疗组细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.05)。结论:LPS能增强5-Fu对胆管癌细胞株QBC939的杀伤作用,并可能在一定程度上可以防止耐药;LPS局部注射治疗方法可抑制肿瘤生长,显著下调肿瘤细胞CXCR4蛋白表达,诱导细胞凋亡。LPS联合化疗药物可能是胆管癌临床治疗的一种合理策略。