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目的:探讨NET-1(C4.8 identifica"tion of novel molecular markers which correlate with HPV-induced tumor progression、P503s、Tspan-1)在结直肠癌中的表达水平与其病理特征的相关性,并通过病例的短期随访,进一步证实NET-1是否可作为结直肠癌早期诊断、预后监测的重要分子生物学指标。方法:以RT-PCR方法和免疫组织化学方法(IHC)检测结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中NET-1的mRNA和蛋白的表达,并利用SPSS19.0软件统计分析入组患者NET-1表达水平与相对应临床病理参数之间的关系。RT-PCR方法从人类结肠正常上皮细胞(NCM460)提取的RNA逆转录获得的cDNA中扩增NET-1的编码区片段,连入19T-simple Vector克隆载体,经过酶切测序验证后插入pIRES2-EGFP真核表达载体中,再次酶切测序验证,得到NET-1的真核表达载体,用于转染HCT116及HT29结直肠癌细胞,并通过抗生素嘌呤霉素筛选建立稳定表达NET-1细胞株及其阴性对照组。以细胞增殖实验、细胞迁移实验,检测NET-1过表达后HCT116及HT29结直肠癌细胞增殖、迁移能力的改变。Western-blot检测HCT116细胞过表达NET-1后金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白水平变化。利用shRNA干扰技术下调HCT116及HT29结直肠癌细胞中的NET-1表达,并检测下调NET-1后HCT116及HT29结直肠癌细胞增殖、迁移能力的改变。Western-blot检测HCT116细胞敲低NET-1后MMP-9蛋白水平变化。将入组结直肠癌患者分为NET-1阳性表达组及阴性表达组,并进行随访,收集数据通过SPSS19.0进行生存回归分析。结果:免疫组织化学染色:结直肠癌患者组织中NET-1表达阳性率高于正常人群组织;Ki-67、MMP-9、VEGF三者的阳性表达与NET-1表达阳性具有一致性;NET-1表达阳性率与肿瘤分化程度的相关性无统计学意义。RT-PCR:NET-1mRNA相对表达量在正常人肠粘膜上皮组织中低于结直肠癌组织;癌旁组织表达量低于癌组织。Western-blot:正常人群中NET-1蛋白表达量低于结直肠癌患者,组织中的蛋白的表达量在不同程度的肿瘤病理组织中表达量不一致,且随着病理程度的恶化呈上升趋势。细胞增殖活力检测:与对照组细胞相比,过表达NET-1的HCT116细胞(HCT116-NET1)增殖能力明显增强(P<0.01)。MTT细胞增殖实验显示,HCT116-NET1细胞24小时及48小时吸光度显著高于对照组(P<0.01)。此研究结果表明,NET-1能增强结直肠癌细胞的体外增殖能力。细胞侵袭能力检测:与对照组细胞相比,过表达NET1的HCT116细胞(HCT116-NET1)侵袭转移能力明显增强(P<0.01)。过表达NET1的HCT116细胞侵袭数目为30.0±3.0,而对照组细胞的平均细胞侵袭数目为16.0±5.0。此研究结果表明,NET-1能抑制结直肠癌HCT116细胞的体外侵袭转移能力。生存分析:经过随访后得到生存分析结果,在NET-1表达呈阳性组的生存时间与阴性组之间存在有差异(P<0.05),并且在不同的病理类型中的生存时间也不一致(P<0.05)。结论:1.NET-l的表达在结直肠癌的发生、发展过程中发挥重要作用;2.NET-l在结直肠癌中的表达与TNM分期、淋巴结转移、病变的分化程度密切相关,且与Ki-67、MMP-9、VEGF亦具有明显相关性;3.结直肠癌中NET-l的表达与患者的生存期相关,高表达NET-l患者预后较差。