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由于编辑效率高且构建快速,CRISPR/Cas9技术极大地推动了外源基因的定点整合研究。外源基因的有效敲入,需要安全位点允许其整合和有效表达,并且不影响细胞或生物体内的内在基因功能。目前,猪基因组中用于外源基因整合的常用的两个位点:Rosa26位点和H11位点。然而,用于转基因研究和制备基因编辑动物的安全整合位点还远远不够。因此,这就需要我们在猪基因组中寻找更多适合外源基因整合的位点。本研究主要以猪miR-17-92基因簇为研究对象,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组途径成功验证了在猪miR-17-92簇整合和表达外源基因以及制备基因修饰猪的潜力。首先,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了EGFP报告细胞系。通过CRISPR/Cas9介导的定点整合技术,我们成功地将特异性抑制EGFP基因的shRNA精确整合至miR-17-92的3’UTR。在猪miR-17-92控制下插入的shRNA基因正常转录并有效抑制EGFP基因的表达。这表明猪miR-17-92允许外源基因整合和有效表达。在上述基础上,我们通过筛选获得了抗猪瘟病毒shRNA定点整合的猪胎儿成纤维细胞系。我们发现抗猪瘟病毒shRNA基因不仅在猪miR-17-92的3’UTR插入后实现了有效的表达,而且不影响细胞的增殖能力和胚胎的早期发育。我们还深入分析了该细胞系中转录产生的siRNA序列的完整性。通过通过测序和序列比对,我们发现目标siRNA序列完全正确。另外,我们在检测的16个潜在的脱靶位点未发现脱靶现象。随后,我们将上述细胞系作为供体细胞通过SCNT制备抗猪瘟的基因修饰猪。可惜的是,在制备基因修饰猪的过程中未发现成功怀孕的受体母猪。推测是由于胚胎移植的代孕母猪的数量较少导致。此外,我们筛选出了能有效靶向人miR-17-92的sgRNA序列,在人HEK 293细胞中成功验证了人miR-17-92整合外源基因的应用潜力。最后,我们成功获得了猪miR-17-92内部携带针对流行性腹泻病毒shRNA基因的整合细胞系并制备了相关的基因修饰猪。我们发现阳性仔猪中针对PEDV shRNA正常转录和有效表达,并且不影响猪miR-17-92的内源性表达。此外,这些基因修饰猪中检测的潜在脱靶位点处未发现脱靶突变。该研究证明插入猪miR-17-92簇内部的外源基因在细胞与个体水平均能高效表达。综上所述,本研究中在猪miR-17-92簇进行外源shRNA基因的定点整合和表达策略,为今后抗病毒研究和基因修饰猪的制备奠定了基础。