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背景:PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着重要的作用,其结构异常或含量减低可能是精子激活卵母细胞失败型男性不育的原因之一,体外表达和纯化有活性的重组人PLCζ蛋白进行生物医学应用的研究一直备受关注。使用纯化的具有活性的重组人PLCζ蛋白进行卵胞浆内注射可能是一种更安全有效的激活卵母细胞的方法,但是关于有活性的重组人PLCζ蛋白的体外表达及纯化一直没有取得大的进展。目的:本研究通过构建不同的表达载体,体外表达和纯化重组人PLCζ蛋白,并进行蛋白活性测定,为探究其作为人工辅助卵母细胞激活生物制剂的可行性奠定基础。方法:将PLCζ蛋白的氨基酸序列提交到蛋白质组学服务器,使用Pro Param软件分析预测PLCζ蛋白全长的基本组成和理化性质。将人PLCζ基因克隆至p Fast Bac-HTA质粒构建重组转移载体,转化DH10Bac发生特异性位点转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9细胞进行蛋白的体外表达;采用Ni2+亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blot及时间飞行质谱对目的蛋白进行鉴定。将优化过的人PLCζ基因克隆至p ET-43.1a（+）质粒,构建含有Nus A融合标签的PLCζ重组表达质粒p ET-43.1a（+）-PLCζ;将表达质粒转化感受态大肠杆菌BL-21（DE3）进行蛋白的原核表达,通过优化IPTG浓度和培养温度提高Nus A-PLCζ融合蛋白的可溶性表达,并对体外表达的蛋白进行纯化和鉴定。通过测定PLCζ蛋白水解p-NPPC反应前后生成黄色的对硝基苯酚浓度变化,根据标准曲线法计算PLCζ蛋白酶的活力,研究重组人PLCζ蛋白的酶学性质。结果:将人PLCζ基因克隆至p Fast Bac-HTA质粒,构建出能高效表达重组病毒的穿梭质粒Bacmid-PLCζ;重组质粒转染的Sf9昆虫细胞培养72 h后病毒感染迹象明显,收集P3代杆状病毒,经测定病毒滴度为5.0×108PFU/m L;重组人PLCζ蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒72 h达到峰值并以分泌的形式表达在细胞培养基中;经Ni2+亲和层析及凝胶过滤层析可获得有活性的重组人PLCζ蛋白。本研究成功构建了含有人PLCζ基因的重组表达质粒p ET-43.1a（+）-PLCζ,通过Nus A融合标签实现了重组人PLCζ蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达;表达产物经Ni2+亲和层析及凝胶过滤层析可获得有活性的重组人Nus A-PLCζ融合蛋白。在相同蛋白浓度条件下,昆虫细胞表达的重组人PLCζ蛋白酶活力为656.64 U/m L,而Nus A-PLCζ融合蛋白的酶活力为150.52 U/m L;两种蛋白最适作用温度为35℃,最适反应p H为8.0,且在p H 7.0～8.5之间具有较好的稳定性。结论:本研究通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达并纯化出有活性的重组人PLCζ蛋白;通过Nus A融合标签实现了重组人Nus A-PLCζ融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究奠定了基础。