黄瓜(Cucumis sativus L.)以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,而α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是催化黄瓜体内水苏糖分解的关键酶。为研究黄瓜体内水苏糖卸出的分子机制,本实验室前期克隆了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的cDNA全长序列。为验证这2个基因克隆的正确性,研究它们的酶学性质,指导后续的分离纯化实验,探索它们在黄瓜水苏糖代谢中的生理功能,本实验采用昆虫杆状病毒表达载体系统离体表达了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因。为此,本实验设计了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的特异引物,运用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增其编码区序列,经连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选重组子,构建杆状病毒表达载体。利用野生型杆状病毒和表达载体共转染健康的昆虫细胞系Sf9,生产重组病毒,离体表达了2个待验证基因。经检测表明2个基因在昆虫细胞中的表达产物均具有酸性α-半乳糖苷酶活性,证明这2个基因确实为酸性α-半乳糖苷酶基因。进一步研究了离体表达的2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对人工底物pNPG的最佳反应pH值、最适反应温度、米氏常数(Km)、最大反应速度(Vm)、D-半乳糖对活性的抑制效应以及对水苏糖、棉籽糖的催化活性。结果表明:黄瓜α-半乳糖苷酶Ⅰ对pNPG的最佳反应pH值为4.8,最适反应温度为30℃,对pNPG的Km为8.99×10-4mol/L,Vm为3.34×10-2mol/L·min;黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅱ对pNPG的最佳反应pH值为6.1,最适反应温度为35-40℃,对pNPG的Km为1.35×10-3mol/L,Vm为3.36 mol/L·min。低浓度的D-半乳糖对2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶活性均具有显著的抑制作用。2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对棉籽糖均具有较高的亲和性,对水苏糖的亲和性相对较低。