第一部分 巨噬细胞CaN/NFAT信号通路在川崎病免疫性冠脉损伤中的作用机制目的:川崎病(Kawasaki Disease,KD)是一种急性自限性全身性血管炎综合征,其主要并发症为冠状动脉扩张或冠状动脉瘤,严重者可出现冠状动脉狭窄、栓塞、心肌缺血或者冠状动脉瘤破裂出血。目前川崎病已取代风湿热成为发达国家儿童获得性心脏病的首要原因。川崎病所引起的冠状动脉炎的典型特征为包含大量巨噬细胞浸润的增生性炎症,且巨噬细胞与淋巴细胞的异常激活被认为与血管损伤形成存在密切相关。先前研究发现通过给予C57BL/6小鼠腹腔注射干酪乳杆菌细胞壁提取成分(Lactobacillus casei cell-wall extract,LCWE),可诱导小鼠出现冠状动脉损伤改变,且其组织病理表现与人类川崎病患者冠脉损伤病理表现相似。因此通过腹腔注射LCWE诱导小鼠免疫性冠脉损伤模型研究川崎病免疫性冠脉损伤的发病机制,对川崎病免疫性冠脉损伤的研究具有重大意义。钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN/Cn)属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,是一种依赖Ca2+/钙调蛋白(CaM)调节的异二聚体。目前研究发现CaN参与多种细胞功能的调节,尤其是在固有免疫和获得性免疫功能的调节方面发挥重要功能。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)是一种重要的调控细胞内信号转导的可诱导的转录因子,最早被发现于T细胞,目前发现在大部分免疫细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞等均有表达,参与了免疫细胞的生长、分化及功能调节。NFAT为钙调神经磷酸酶CaN的主要作用底物,其活性受钙调蛋白磷酸酯酶(calcineurin,CaN)的调节,主要通过受体-Ca2+-CaN信号途径被激活,活化的CaN可诱导NFAT发生脱磷酸化,增强了 NFAT与靶DNA的亲和力,使NFAT进入核内诱导靶基因的转录,从而发挥其基因调控功能。先前多项研究通过GWAS、连锁不平衡分析等方法对川崎病患者易感基因进行筛查发现Ca2+/CaN-NFAT信号通路在川崎病的发生发展中有重要作用,但具体的分子作用机制尚不明确。因此本课题的主要目的是通过建立免疫性冠脉损伤模型,对巨噬细胞中Ca2+/CaN/NFAT信号通路在免疫性冠脉损伤形成中的作用及作用机制进行研究。方法:通过LCWE体外诱导RAW264.7单核/巨噬细胞活化,构建NFAT单荧光素酶报告系统,检测LCWE是否能体外诱导NFAT信号通路的激活,同时通过流式细胞术、ELISA、WB和qPCR检测NFAT1和NFAT2及相关细胞因子的表达情况;腹腔注射LCWE诱导川崎病免疫性冠脉损伤模型,WB和qPCR检测NFAT1和NFAT2及相关细胞因子的表达情况;分离提取胞浆胞核蛋白验证LCWE诱导巨噬细胞活化后NFAT核转位情况;通过过表达或敲低NFAT1或NFAT2,观察NFAT对LCWE诱导的巨噬细胞活化的调控作用;给予CaN抑制剂环孢霉素(cyclosporine A,CsA),通过NFAT单荧光素酶报告系统、ELISA、WB和qPCR检测观察CsA对LCWE诱导的巨噬细胞中NFAT信号通路的调控作用,并通过细胞免疫荧光观察CsA对LCWE诱导的巨噬细胞中NFAT活化的抑制。结果:1.形态学观察发现LCWE处理组巨噬细胞形态较对照组发生明显改变,ELISA与qPCR检测发现其细胞培养基上清液中IL-6,IL-1β,TNF-α和MIP-1α与对照组相比显著升高(P<0.05),提示LCWE可体外诱导巨噬细胞发生活化。2.WB和qPCR结果显示经LCWE体外诱导后,巨噬细胞中NFAT1和NFAT2表达明显上调(P<0.05),荧光素酶报告基因检测和分离提取胞浆胞核蛋白结果充分证实LCWE可促进NFAT功能激活,发生核转位。提示LCWE可在体外诱导激活巨噬细胞中NFAT信号通路。3.腹腔注射LCWE诱导小鼠免疫性冠脉损伤模型,发现LCWE腹腔注射后第14天心肌组织和骨髓来源巨噬细胞中NFAT1和NFAT2表达明显增加(P<0.05)。且 14 天和 28 天的小鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1a和MCP-1的含量均提示LCWE处理组显著高于PBS组(P<0.05)。动物试验结果提示LCWE可诱导川崎病免疫性冠脉损伤模型中NFAT信号通路的激活。4.通过转染慢病毒,获得稳定过表达或敲低NFAT1或NFAT2的细胞系,LCWE体外诱导巨噬细胞发现:过表达NFAT1或NFAT2均能使LCWE诱导的IL-6,IL-1β和TNF-α显著升高(P<0.01);敲除NFAT1或NFAT2后,LCWE诱导的IL-6,IL-1β和TNF-α表达显著下降(P<0.01)。提示NFAT信号通路在LCWE诱导的巨噬细胞活化中可参与调控IL-6,IL-1β和TNF-α的表达。5.给予巨噬细胞CsA预处理,荧光素酶报告基因检测结果显示CsA处理组的荧光素酶活性显著低于CsA未处理组(P<0.05),WB和qPCR结果显示CsA可下调LCWE所诱导的NFAT1和NFAT2的表达增加(P<0.05),ELISA和qPCR结果证实经CsA预处理后IL-6,IL-1β和TNF-α的表达量显著下调(P<0.01)。免疫荧光结果显示,CsA可有效抑制LCWE所诱导的NFAT1和NFAT2的核转位。以上结果均提示CsA可有效抑制LCWE诱导的巨噬细胞中NFAT的激活,从而调控IL-6,IL-1β和TNF-α的表达。结论:1.LCWE可体外诱导巨噬细胞中NFAT信号通路的活化。2.LCWE可诱导川崎病免疫性冠脉损伤模型中NFAT信号通路的激活,相关炎症因子表达增加。3.通过过表达和敲低NFAT1和NFAT2发现NFAT信号通路在LCWE诱导的巨噬细胞活化中可参与调控IL-6,IL-1β和TNF-α等促炎因子的表达。4.CsA作为CaN抑制剂,可下调LCWE所诱导的NFAT1和NFAT2的表达增加,抑制LCWE所诱导的NFAT的核转位,从而抑制LCWE诱导的巨噬细胞中NFAT信号通路的激活,调控IL-6,IL-1β和TNF-α等相关炎症因子表达。第二部分 川崎病中CaN、NFAT1血清表达量的研究目的:川崎病(Kawasaki Disease,KD)是一种病因及发病机制尚不明确的急性自限性免疫性血管炎综合征,其主要并发症为冠状动脉扩张和冠状动脉瘤,严重者可发生冠脉狭窄、栓塞引起心肌梗死。先前研究通过对川崎病患者易感基因进行筛查发现Ca2+/CaN-NFAT信号通路在川崎病的发生发展中有重要作用,本课题第一部分研究结果发现巨噬细胞中CaN/NFAT信号通路在LCWE所诱导的免疫性冠状动脉损伤中发挥重要。此外,相关临床研究发现给予IVIG耐药患儿CsA 口服治疗的有效性和耐受性良好。然而,CaN与NFAT1在川崎病患者发病过程中的表达情况目前并无相关研究。因此本研究的主要目的是明确川崎病患者各个阶段血清中CaN、NFAT1含量的变化,从临床水平对CaN/NFAT信号通路在川崎病中的作用做进一步探索研究,并为临床应用钙调神经磷酸酶抑制剂CsA提供依据。方法:收集自2015年11月—2017年3月就诊于浙江大学医学院附属儿童医院且确诊为川崎病的患儿(共74例)急性期,无发热期和亚急性期以及健康体检儿童(共66例)血清,采用ELISA法检测各个时期的CaN、NFAT1的血清含量。统计各组合并冠状动脉损伤及丙球耐药患者并进行分组比较,并对白细胞(WBC)、中性粒细胞(N)、C 反应蛋白(CRP)、血小板(PLT)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-y等相关临床指标进行统计。结果:川崎病急性期患者血清中CaN和NFAT1的水平显著高于无发热期和亚急性期,且经丙球治疗后逐渐下降。与健康对照组相比,川崎病患儿在急性期、无发热期和亚急性期的CaN和NFAT1血清水平均显著升高。经治疗后,丙球敏感者的血清中CaN、NFAT1水平显著下降(P值均<0.05)。但在丙球耐药患者中,血清中CaN水平下降缓慢(急性期:2.67±0.50ng/ml,治疗后无发热期:2.48±0.48ng/ml;亚急性期:2.34±0.54ng/ml),均无明显统计学差异(P>0.05)。对丙球耐药和丙球敏感患者进行比较,其CaN和NFAT1血清水平在急性期、无发热期和亚急性期并无明显差异。对有无冠脉损伤患者的CaN的血清水平进行比较并无显著差异。然而,在无发热期,合并冠脉损伤患者的NFAT1要显著低于无冠脉损伤患者(269±12pg/ml vs 2866±25pg/ml,P=0.003)。结论:1.川崎病急性期存在CaN、NFAT1血清水平的显著升高,且含量随丙球治疗后显著下降,提示CaN/NFAT信号通路可能参与了川崎病的发病过程,同时为川崎病临床应用钙调神经磷酸酶抑制剂提供了新的证据支持。2.丙球敏感者经丙球治疗后血清中CaN、NFAT1水平显著下降。但在丙球耐药患者中,血清中CaN水平下降缓慢,提示丙球耐药患者应用钙调神经磷酸酶抑制剂治疗有效可能与耐药患者C aN/NFAT信号通路的异常增强被磷酸酶抑制剂有效抑制有关。