目的:人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）是引起人类获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）即艾滋病的主要病原体。HIV感染人体后,机体免疫功能严重缺损,常因合并严重的机会性感染而最终导致死亡。HIV病毒限制因子是指存在于宿主细胞内的抑制病毒复制的蛋白质,是机体防御病毒感染的第一道防线。现阶段已经发现了多种HIV病毒限制因子包括SAMHD1（SAM And HD Domain Containing Deoxynucleoside Triphosphate Triphosphohydrolase 1,SAMHD1）、APOBEC3G（apolipoprotein B-editing catalytic polypeptide 3G proteins,APOBEC3G）、TRIM5（tripartite motif-containing protein 5,TRIM5）和Tetherin（BST-2/CD317/HM1.24）等。HIV病毒限制因子的研究能够解释机体抵御病毒感染的机制及病毒逃逸机体抑制的机制,为艾滋病的治疗提供新的研究思路和方向,因此积极寻找新型的HIV病毒限制因子至关重要。课题组在前期寻找抑制静息CD4⁺T细胞释放感染性子代病毒的病毒限制因子研究中,寻找到了一种在静息CD4+T细胞和激活的CD4+T细胞差异性表达基因的——TRABD2A（Tra B domain containing 2A,TRABD2A）。TRABD2A是一种金属蛋白酶,其蛋白酶活性受多种金属离子的调控,目前已经被证实的功能是TRABD2A能够裂解Wnt蛋白,通过拮抗Wnt蛋白的作用维持脑组织的正常结构。目前,国内外尚无TRABD2A在HIV领域的相关研究报道,同时尚未明确TRABD2A对HIV的复制的影响。此外,通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测TRABD2A在不同细胞的表达水平后发现TRABD2A除表达于静息CD4⁺T细胞中,在单核细胞来源的树突状细胞（Monocyte derived Dendritic cells,MDDCs）中有较高的表达,而在其他细胞中表达量极低或者无表达。树突状细胞（dendritic cells,DCs）作为人体最重要的专职抗原提呈细胞,在HIV感染时发挥重要的作用。DCs由于表达HIV的CD4受体和辅助受体而成为HIV重要的靶细胞之一。HIV虽然能够感染DCs,但是仅有约1%的DCs被感染,同时感染进入DCs病毒因为复制过程被阻断而难以释放感染性的子代病毒。因此,DCs中也一定存在抑制HIV复制的病毒限制因子。虽然现阶段已发现SAMHD1、APOBEC3G及Tetherin等均能在DCs中抑制HIV的复制,但是均未能很好的解释为什么HIV在DCs中的复制过程被阻断且难以释放子代病毒。我们的研究发现TRABD2A在MDDCs中有较高的表达,那么TRABD2A是否为阻断HIV在MDDCs中复制及释放感染性子代病毒的原因之一?我们的研究旨在探索TRABD2A对HIV复制的影响和具体的分子机制,同时探索TRABD2A在MDDCs中对HIV复制的影响,明确TRABD2A是否为抑制HIV在MDDCs中复制及释放子代病毒的病毒限制因子。TRABD2A与HIV的研究将进一步揭示免疫细胞对抗HIV病毒感染的新机制,为艾滋病的临床治疗供新的研究靶点和方向。研究方法:1.研究对象:对于TRABD2A的是否抑制HIV-1病毒复制的研究,主要应用人肾上皮细胞株293T细胞和TZM-bl细胞;对于TRABD2A的抑制HIV-1复制的机制研究,主要应用293T细胞和TZM-bl细胞;对于内源性TRADB2A在MDDC中抑制HIV-1病毒复制的功能研究,主要提取健康供者的EDTA抗凝外周血的PBMC,磁珠分选CD14⁺单核细胞之后诱导为MDDCs。2.血液标本处理:使用淋巴细胞分离液Ficoll提取健康人外周血PBMC,磁珠阳选CD14⁺单核细胞,使用细胞因子GM-CSF和IL-4将单核细胞诱导为MDDCs。3.贴壁细胞培养:293T细胞及TZM-bl细胞采用含10%FBS和100U/mL青-链霉素的DMEM培养基培养,细胞培养于37℃,含5%CO₂的培养箱中,每隔2d传代一次。4.质粒转染:应用jet PRIME转染试剂在293T细胞中进行质粒转染,应用Lipofectamine 2000转染试剂在293T细胞中进行siRNA转染,应用Lipofectamine3000转染试剂在MDDCs中转染siRNA。5.sh RNA慢病毒包装:将3×10⁶个293T细胞铺于10cm的培养盘中,24h后使用jet PRIME Transfection Reagent转染试剂进行质粒转染:5μg sh RNA慢病毒表达质粒、3.75μg p AX2包装质粒和1.25μg p MD2G质粒,6h后细胞换液,48h收集细胞上清,离心后经0.45μm滤器过滤,ELISA检测上清p24的含量,之后将病毒分装,-80℃冻存。6.HIV_NL4.3、HIV_AD8和HIV_89.6病毒包装:将3×10⁶个293T细胞铺于10cm的培养盘中,24h后使用jetPRIME Transfection Reagent转染试剂进行转染质粒10μg pNL4.3、pAD8及p89.6,6h后细胞更换新鲜培养基,48h收集细胞上清,离心后经0.45μm滤器过滤,ELISA检测病毒的p24的含量,之后将病毒分装,-80℃冻存。7.荧光素酶检测:用Passive Lysis Buffer将TZM-bl或者293T细胞裂解后,吸取50μL裂解上清至96孔黑板,加入25μL Promega荧光素酶底物,酶标仪读取数值检测荧光素酶的反应强度。8.实时荧光定量PCR（Real-time PCR）:应用TRIzol提取细胞的RNA,TAKARA的逆转录试剂盒PrimeScript?RT reagent Kit with g DNA Eraser将RNA逆转录成cDNA,应用TB Green?Premix Ex Taq?II（Tli RNaseH Plus）进行荧光实时定量反应。9.蛋白免疫印迹（Western Blot）:细胞用RIPA裂解后,将裂解液超声,提取细胞中的蛋白,BCA法检测蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE loading buffer,煮沸变性。蛋白电泳100V,1h,4℃环境中35V过夜转印。PVDF膜用BSA封闭1h,一抗室温条件下孵育1h,PBST溶液洗5min×3次,二抗室温孵育30min,PBST溶液洗5min×3后,进行ECL化学发光。10.免疫荧光检测:将玻璃爬片放置于12孔板中,将293T细胞培养在孔板中进行细胞爬片,24h后取出细胞爬片,PBS洗去培养基后,用固定液进行细胞固定,室温条件下固定20min;PBS洗3次,洗去固定液,在爬片上滴加细胞破膜液,室温条件下破膜15min,PBS洗3次洗去细胞破膜液,用BSA封闭60min。封闭结束后,加入稀释的一抗,4℃条件下过夜孵育;PBS洗去一抗后加入荧光标记的二抗,避光室温孵育30min,洗去二抗后滴加含DAPI的抗淬灭封片剂封片,荧光显微镜观察及拍照。11.ELISA检测p24抗原:据实验样本量取出Microelisa Plate平衡至室温。稀释Wash buffer,将收取的细胞上清样本离心后,用培养基进行5000倍稀释;标准品按说明书进行稀释（得到标准品的浓度依次为100pg/mL、50pg/mL、25pg/m L、12.5pg/m L、6.3pg/mL、3.1pg/mL）。样本及标准品准备好后,按试剂盒说明书进行操作,加入过氧化物酶底物并温育后,酶标仪450nm读取数值并绘制标准曲线,根据稀释倍数计算每孔样本p24的浓度。12.统计学分析:应用Graphpad8.0进行数据的统计学分析和作图。计量资料以±表示,计量资料两组之间比较应用非配对t检验进行差异分析,P<0.05认为有统计学差异。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001结果:1.TRABD2A抑制HIV-1病毒复制的研究1.1在293T细胞按不同比例（3:1,2:1和1:1）同时转染TRABD2A-myc/Mock（1.5μg,1.0μg,0.5μg）质粒和HIV-1病毒质粒pNL4.3（0.5μg）,48h后分别收取细胞上清和细胞,吸取200μL细胞上清感染TZM-bl细胞,同时检测上清中的病毒p24和病毒RNA;细胞提取total RNA,real-time PCR检测gag RNA的变化。从Luciferase结果中我们看出,293T细胞转染TRABD2A后,产生有感染性的HIV明显低于对照组,说明转染TRABD2A后产生有感染性的病毒明显减少,同时产生的HIV-1病毒p24显著降低,上清中病毒RNA明显低于对照组,说明TRABD2A能够有效的抑制HIV-1病毒复制,而Gag RNA基本不发生变化,即TRABD2A不影响HIV-1病毒的转录;在293T细胞转染1.5μg和1.0μg TRABD2A-myc/Mock质粒后,感染HIV-1假病毒HIV_NL4.3-Luc（VSVG）,24h后裂解293T细胞检测Luciferase的变化。293T细胞过表达TRABD2A后Luciferase的表达与对照组没有显著差异,说明TRABD2A不影响HIV-1病毒复制的早期过程及病毒的转录,而在HIV病毒翻译后的晚期阶段发挥抗病毒功能。1.2 TRABD2A的转录本TRABD2A-201具有最明显的抗病毒功能,其抑制病毒的倍数可达1087倍,TRABD2A-202也具有抑制HIV-1病毒复制的功能,其抗病毒功能明显低于TRABD2A-201,而转录本TRABD2A-203并不能抑制HIV-1病毒复制,没有抗病毒作用。TRABD的另外一个蛋白亚型TRABD2B也具有较明显的抗病毒作用,与对照组相比,TRABD2B抑制HIV病毒复制的倍数可达186倍。Champizee的TRABD2A-201也具有抗HIV-1病毒复制的作用,尽管抗病毒能力明显低于人的TRABD2A-201,这表明灵长类动物中金属蛋白酶TRABD家族的保守抗HIV-1功能。1.3 TRABD2A能够有效的抑制不同嗜性的HIV-1毒株:X4毒株BH10、R5毒株BaL,R5毒株AD8,X4和R5毒株89.6和HIV-2野生型毒株HIV-2_ST及SIV_mac239病毒的复制,具有广泛的抗病毒功能。1.4 TRABD2A抑制HIV-1病毒复制的能力依赖其金属蛋白酶活性,Ni²⁺、Co²⁺及金属离子螯合剂1,10-菲啰啉（1,10-phenanthroline）能够抑制TRABD2A的抗病毒能力,而Mn²⁺促进TRABD2A的抗病毒能力。2.TRABD2A抑制HIV-1病毒复制的机制研究2.1在293T细胞中同时转染TRABD2A-myc/Mock和pNL4.3病毒质粒,48h后收集细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测TRABD2A是否能够直接降解HIV-1病毒的Gag蛋白。与对照相比,转染TRABD2A-myc后Gag前体蛋白p55和核心抗原p24的蛋白表达明显降低,HIV-1病毒包膜糖蛋白Env的表达基本不发生变化,说明TRABD2A对HIV-1病毒包膜糖蛋白Env的表达没有影响。随着Mn²⁺的浓度增加,Pr55-Gag蛋白表达量逐渐下降,当Mn²⁺的浓度增加到200μM时,基本检测不到Pr55-Gag蛋白条带。综上结果,TRABD2A主要是通过降解HIV-1的Gag蛋白抑制病毒的包装,进而抑制HIV-1病毒复制。2.2磷酸肌醇特异性肌醇多磷酸5-磷酸酶IV（5ptase IV）的过表达来减少胞膜上的磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯（Ptd Ins（4,5）P2）后,5ptase IV过表达显著降低TRABD2A的抗HIV-1活性并减少TRABD2A介导的Gag前体的降解;分别纯化胞膜和胞质蛋白,在胞膜蛋白中,TRABD2A能够明显降解Pr55-Gag,而在胞质蛋白中,TRABD2A过表达并没有引起Pr55-Gag表达下降,说明TRABD2A不能在胞质中降解Gag,只能在细胞膜上降解Gag蛋白发挥抗病毒功能;TRABD2A不能降解缺失N端的肉豆蔻酰化序列的Pr55-Gag（?Myr-MA-Gag）,说明Gag不能靶向到细胞膜上就不能被TRABD2A降解。综上结果,TRABD2A主要通过在细胞膜上降解Pr55-Gag抑制HIV-1病毒的复制。3.MDDCs中的内源的TRABD2A抑制HIV-1病毒的复制3.1 RNA-Seq的结果显示单核细胞中基本没有TRABD2A的表达,诱导成为MDDCs后TRABD2A的表达量显著增高,免疫荧光结果显示TRABD2A主要分布在MDDCs的细胞膜上。3.2使用siRNA敲减MDDCs中的TRABD2A后,使用高剂量（50ng）和低剂量（5ng）HIV_AD8感染MDDCs,72h后上清中p24增高6-8倍,说明TRABD2A能够抑制MDDCs中HIV的复制。使用sh TRABD2A的慢病毒感染MDDCs敲减MDDC中的TRABD2A之后感染高剂量（50ng）和低剂量（5ng）HIV_AD8,低剂量病毒感染时,p24表达增高的8-10倍。shTRABD2A敲减TRABD2A后感染高剂量（50ng）和低剂量（5ng）HIV_AD8和HIV_89.6后连续培养15天,检测MDDCs中TRABD2A对HIV-1病毒多轮复制的作用。敲减TRABD2A后,上清中的p24的量随着病毒感染天数的增加而逐渐累积增多,且与对照组相比,敲减TRABD2A后产生的p24的变化倍数随着感染天数的增加而增高。综上实验结果,MDDCs中的内源性的TRABD2A具有抑制HIV-1病毒复制的作用。结论:1.TRABD2A能够在293T细胞中有效的抑制HIV-1病毒的复制,具有明显抗病毒功能,是一种新型的病毒限制因子。2.TRADB2A不影响病毒的逆转录、入核、整合、转录和翻译的过程,但是影响HIV-1病毒的p24的产生,说明TRABD2A在HIV-1病毒感染的后期起抗病毒功能。3.金属离子及金属离子螯合剂1,10-菲啰啉（1,10-phenanthroline）抑制TRABD2A的金属蛋白酶活性后病毒复制增多,TRABD2A的抗病毒作用明显降低,说明TRABD2A的抗病毒作用依赖其金属蛋白酶活性。4.TRABD2A主要通过在细胞膜上与HIV的Gag蛋白结合后降解Gag蛋白,使HIV子代病毒在不能在细胞膜上完成包装,进而抑制病毒的复制。5.敲除MDDCs中的内源性的TRABD2A后,HIV-1病毒复制增加,说明TRABD2A在MDDCs中也发挥抗病毒功能,是MDDCs中一种新型的病毒限制因子。