磺胺类药物残留ELISA快速检测试剂盒的研制

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本研究通过单克隆抗体的纯化,直接竞争ELISA方法的确立,样品提取方法的优化,直接竞争ELISA标准曲线的建立,动物试验以及与国外同类试剂盒和仪器方法的比较,建立了检测食源性动物产品中磺胺嘧啶和磺胺类药物残留的两种ELISA检测方法,并在此基础上相应地研制出两个快速检测试剂盒。研究结果如下: 1、利用本实验室已有的抗磺胺嘧啶单克隆抗体细胞株(SD-4)经复苏、筛选、生产、纯化得到抗磺胺嘧啶单克隆抗体。用重氮化—偶联法将磺胺嘧啶(SD)与卵清白蛋白(OVA)按投料摩尔比2:1连接制备了包被抗原(SD-OVA),用过碘酸钠法将SD-OVA与辣根过氧化物酶(HRP)按投料摩尔比1:2连接制备了酶标抗原(SD-OVA-HRP)。药物竞争试验确定了直接竞争ELISA方法;将常规包被与微波包被法从方法的灵敏度、包被时间、包被稳定性进行比较,确立微波包被法。直接竞争ELISA试验在1ng/mL~729ng/mL浓度范围建立标准曲线方程y=12.05x+2.2538,线性相关系数R2=0.995,IC50为41.7ng/mL。与磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺喹噁啉(SQ)及磺胺甲噁唑(SMZ)的交叉反应率分别为:1.7%、3.1%、<0.01%、<0.01%、<0.01%、3.4%。建立了猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶中SD提取方法,进而研制出SD酶联免疫检测试剂盒,在猪肉、鸡肉、鸡肝中定量限为20μg/kg,回收率70%~110%,批间变异系数<26%;在鸡蛋、牛奶定量限为5μg/kg,回收率60%-120%,批间变异系数<32%。与同类试剂盒比较,结果表明自制试剂盒与英国试剂盒准确度、精密度水平相当,灵敏度低于英国试剂盒。饲喂仔肉鸡含500mg/kg SD饲料7d,停药后连续检测5d,自制试剂盒测定鸡肉中SD残留量与高效液相色谱法(HPLC)测定结果相近。同时,饲喂蛋鸡含400mg/kg SD饲料5d,停药7d连续检测,自制试剂盒与国外试剂盒测定结果相符合。 以上结果表明,本研究研制的试剂盒能够满足猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶中SD残留检测要求,试剂盒研制工作基本完成。 2、利用本实验室已有的抗磺胺类药物单克隆抗体的细胞株(SDL-4)采取与SD-4株细胞相同步骤得到抗磺胺类药物单克隆抗体。采用混合酸酐法将本实验室合成的磺胺类药物母核结构药物(SDL)与人血清白蛋白(HSA)按投料摩尔比2:1连接制备了包被抗原SDL-HSA,用过碘酸钠法将SDL-HSA与辣根过氧化物酶(HRP)按1:2连接制备了酶标抗原(SDL-HSA-HRP)直接竞争ELISA方法10ng/mL~2430ng/mL范围建立标准曲线方程y=14.571x+2.2619,R2=0.987,IC50为153.0ng/mL,与SMM、SMD、SQ、SDM、SD、SM2、SMZ、磺胺甲氧嗪(SMP)和三甲氧苄氨嘧啶(TMP)的交叉反应率分别为:166.8%、100%、105%、38.7%、11.9%、4.9%、<0.01%、12.0%、<0.01%。建立猪肉、鸡肉组织中SAs提取方法,进而研制出SAs酶联免疫检测试剂
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