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目的胰腺癌是恶性程度最高的人类肿瘤之一,根治性手术仍然是其唯一可能治愈的手段。然而,胰腺癌手术切除率低,仅有<15%的患者可能手术切除。即使如此,根治性切除(R0)的患者术后5年生存率仅为15-20%。手术切除率低和术后高复发的特点使辅助治疗对胰腺癌的治疗具有重要的价值。放射治疗是胰腺癌治疗的重要辅助治疗方法,单独或配合化疗有可能提高切除率及改善预后,然而,胰腺癌对放、化疗高度抵抗。因此,寻找一种科学可行的途径来增强放、化疗疗效,改善预后成为了胰腺癌治疗领域研究的热点。XIAP和Survivin是IAPs家族中凋亡抑制作用最强的两种因子,参与了包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤的增殖和转化,并与其放、化疗抵抗密切相关。本研究的主要内容包括：①探讨胰腺癌细胞系中XIAP和Survivin的表达与放疗抵抗之间的关系。②探讨运用慢病毒载体介导RNAi稳定抑制胰腺癌细胞系中XIAP和／或Survivin表达的可行性及对胰腺癌放疗敏感性的影响。方法①体外培养人胰腺癌细胞系Panc-1、Sw1990、Bxpc-3和Miapaca-2，克隆形成实验检测放疗敏感性；实时定量RT-PCR和Western Blot检测亚致死剂量(1Gy)高能X线体外照射处理前后XIAP和Survivin的表达变化；对亚致死剂量X线处理后的胰腺癌细胞和原始胰腺癌细胞行致死剂量X线照射后,检测Caspase-3/7活性和细胞死亡率变化。②针对XIAP和Survivin,分别构建shRNA慢病毒载体,包装病毒后,感染胰腺癌细胞株Swl990,检测对XIAP和Survivin的表达抑制效率；筛选稳定克隆并扩大培养,检测稳定抑制XIAP和Survivin的效率及XIAP或Survivin稳定抑制后对细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响。同时选择抑制效率最好的稳定克隆,应用直接细胞悬液接种法建立胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤模型,比较XIAP或Survivin稳定抑制后细胞的成瘤能力。③以XIAP-shRNA和Survivin-shRNA慢病毒同时感染胰腺癌细胞株Sw1990,筛选稳定克隆,检测XIAP和Survivin同时稳定抑制的效率及XIAP和Survivin同时稳定抑制后对细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响,并与单独抑制XIAP和Survivin的策略进行对比。结果①4种胰腺癌细胞株中均有XIAP和Survivin表达,且表达水平最高的Panc-1放疗抵抗性最高,表达居中的Sw1990放疗中度抵抗,而表达最低的Miapaca-2对放疗最敏感。亚致死剂量X线可诱导4种胰腺癌细胞株中XIAP和Survivin表达升高,且能显著降低致死剂量X线照射诱导的Caspase-3/7活性升高和细胞死亡率(Panc-1、Sw1990、Miapaca-2)。②我们分别针对XIAP和Survivin,分别成功构建3对shRNA慢病毒载体：Lv-shRNA-XIAP-1(LV-X1)、Lv-shRNA-XIAP-2(LV-X2)、Lv-shRNA-XIAP-3(LV-X3)和Lv-shRNA-Survivin-1(LV-S1)、Lv-shRNA-Survivin-2(LV-S2)、Lv-shRNA-Survivin-3(LV-S3),并包装出较高滴度的慢病毒。感染结果显示,慢病毒载体能高效、稳定的感染Sw1990细胞。瞬转的结果表明：LV-X1、Lv-X2、Lv-X3对Sw1990细胞的XIAP mRNA抑制率均达70%以上蛋白抑制率大于95%(均P<0.05)；LV-S1对Sw1990细胞的Survivin mRNA抑制率(73.5±1.85)%,蛋白抑制率(87.64±5.57)%(均P<0.05),LV-S2、LV-S3无显著抑制效果。③我们成功筛选出XIAP表达稳定抑制的胰腺癌细胞株Sw1990-X1、X2、X3, XIAP的mRNA抑制率分别为(81.79±6.59)%、(71.89±3.14)%、(73.67±0.36)%,蛋白抑制率分别为(98.54±0.82)%、(97.33±0.49)%和(97.62±0.40)%(均P<0.05)。MTT检测显示Xl、X3细胞增殖显著受到抑制,且X1、X3放疗后的Caspase-3/7活性、细胞死亡率及细胞凋亡率(流式细胞仪)均显著增加。各组细胞克隆形成率随X线照射剂量(0、2、3、4、5Gy)升高而下降；同一剂量X线照射下X1的克隆形成率均显著低于对照组,细胞存活曲线显示：X1平均致死剂量下降至1.32Gy(多靶单击模型),放射增敏比(D0比)为1.65,X1的放疗敏感性显著增加。我们成功建立3组胰腺癌皮下成瘤模型(Sw1990、Sw1990-Xnc、Sw1990-X1), X1组成瘤较晚,且肿瘤生长缓慢,除第1个观察点外,肿瘤体积在每个观察点都明显小于Xnc组和Sw1990组；观察结束时,X1瘤重小于Xnc组和Swl990组,肿瘤生长抑制率44.14%。④我们成功筛选出Survivin表达稳定抑制的胰腺癌细胞株Sw1990-S1,Survivin mRNA表达抑制率为(76.51±0.99)%,蛋白表达抑制率为(49.32±2.20)%,放疗后的Caspase-3/7活性、细胞死亡率及细胞凋亡率(流式细胞仪)均显著增加。各组细胞克隆形成率随X线照射剂量(O、2、3、4、5Gy)升高而下降；同一剂量X线照射下S1的克隆形成率均显著低于对照组,细胞存活曲线显示：平均致死剂量下降至1.11Gy(多靶单击模型),放射增敏比(D0比)1.82,S1放疗敏感性显著增加。我们成功建立3组胰腺癌皮下成瘤模型(Sw1990、Sw1990-Snc、Sw1990-S1), S1组成瘤时间显著延长,且肿瘤生长缓慢,肿瘤体积在每个观察点都明显小于Snc组和Sw1990组；观察结束时,S1瘤重显著小于Xnc组和Sw1990组,肿瘤生长抑制率达78.95%。⑤我们对Sw1990细胞同时共感染Lv-X1和Lv-S1,并成功筛选出XIAP和Survivin同时稳定抑制的稳定感染株X1S1。XIAP和Survivin mRNA表达抑制率分别为(56.53±3.38)%和(56.19±3.31)%,蛋白表达抑制率分别为(56.26±5.18)%和(30.72±8.16)%(均P<0.05)。与对照相比,X1S1的生长曲线显示其生长显著受到抑制。放射治疗结果表明,X1S1放疗后的Caspase-3/7活性、细胞死亡率均显著增加；与X1和S1相比,Caspase-3/7活性显著增加,但细胞死亡率无显著差别。细胞克隆形成率随X线照射剂量(O、2、3、4、5Gy)升高而下降；同一剂量X线照射下X1S1的克隆形成率均显著低于对照组,且小剂量X线(2Gy和3Gy)照射后的克隆形成率显著低于S1和X1。细胞存活曲线显示：平均致死剂量下降至0.90Gy(多靶单击模型),放射增敏比(D0比)2.26,x1S1放疗敏感性显著增加。X1S1的放疗敏感性高于于X1和S1。结论①XIAP和Survivin在胰腺癌细胞系Panc-1、Sw1990、Bxpc-3和Miapaca-2中均有表达,表达高低与放疗敏感性有关,是胰腺癌细胞系可诱导的、组成性的放疗抵抗因子。②稳定抑制XIAP或Survivin表达,能显著抑制Sw1990的细胞增殖和长期存活,减弱成瘤能力,提高放疗敏感性。③同时稳定抑制XIAP和Survivin表达,与单独稳定抑制XIAP或Survivin表达相比,能更有效增加Sw1990的放疗敏感性。