研究背景与目的食管鳞癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC),它是来自食道上皮细胞的原发性食管癌的其中一种类型,在世界范围内尤其是在中国有着很高发病率的一种恶性肿瘤。ESCC的目前的治疗技术包括手术、放疗和化疗,尽管目前随着早期诊断和治疗方法上的进步,但ESCC却仍然是致死率很高的恶性肿瘤之一。在我国的食管癌患者中,约有90%以上的患者病理类型为食管鳞状细胞癌。在解剖上,食管组织结构与其他消化管道存在差异,在食管的粘膜固有层和粘膜肌层中含有丰富的淋巴管道,因此,以至于在T分期较早的食管癌中也可以发生淋巴结的转移。资料显示,在手术完全切除的食管癌患者中,仍有许多早期患者在完全切除肿瘤后的2-3年之内仍然出现淋巴结的转移性复发。因此发现新的、有效的抗食管鳞癌的方法是当务之急。随着广大研究者对肿瘤分子机制不断的深入认识,现在已将恶性肿瘤定义为一种多因子、多步骤和多基因参与的全身性疾病。因此,在近几年中,肿瘤的生物学治疗以及基因治疗成为肿瘤治疗的研究热点和新希望。许多研究表明食管鳞癌的发生和发展是多因素,多步骤和多个基因参与的结果。抑癌基因也称作隐性癌基因,这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负性调节作用,并能潜在地抑制肿瘤生长。如果抑癌基因的功能失活或出现基因缺失、突变等异常,就可能导致细胞发生恶性转化进而导致肿瘤的发生。肿瘤抑制基因的失活和变异的机制参与ESCC通过遗传和表观遗传异常的积累发展,演变从蔓延前的侵入性食管癌病变,一般以恶性细胞表现出异常的重要基因表达。因此,发现参与ESCC肿瘤发生和发展的新基因,在探索食管鳞癌的生成和发展中具有重要的临床价值。Runt相关转录因子3(runt-related transcription factor 3 gene, RUNX3)蛋白是转化生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)信号转导通路的一个转录因子,它是哺乳动物Runt家族进化的基础,其定位于人染色体1号短臂1p36上。Runt家族成员均具有含123个氨基酸RuntDomain(RD区域),Runx蛋白与Smad2、 Smad3形成复合物传递TGF-β/activin信号,与人类疾病的发生密切相关。RUNX3对细胞生长起负性调节,在TGF-β介导的细胞周期调控、细胞分化与凋亡过程中起到重要的作用。RUNX3首先在胃癌中发现,其广泛表达于多种细胞中,如消化道上皮细胞、间叶细胞、血液细胞及神经细胞等,与细胞生长、发育、分化及凋亡有关,其缺失或失活都可导致多种消化系恶性肿瘤的发生而倍受关注。临床试验证实RUNX3阴性表达时肿瘤中淋巴道侵袭能力和淋巴结转移数目均明显增高,RUNX3阴性表达与食管鳞癌预后不良相关,可能是影响预后的重要因素,即RUNX3蛋白表达下调与食管鳞癌的临床TNM分期及淋巴结转移相关,参与食管癌变进展过程。但是目前尚没有关于RUNX3对食管鳞癌细胞分子水平作用研究的相关报道。本研究通过应用免疫组织化学、western-blot免疫印迹、实时定量-聚合酶联反应的实验方法分别从蛋白和基因的不同角度研究了RUNX3在食管鳞癌组织中的表达以及对食管鳞癌细胞系生物学活性和肿瘤发生的相关性,并探讨了RUNX3与食管鳞癌各临床病理特征及预后之间的关系。旨在为探索食管癌的发生、发展机制,寻找特异的预后指标,为食管鳞癌的治疗确定新的治疗目标和提供基因治疗食道癌的理论基础。第一部分RUNX3过表达在体内体外对食管鳞癌Eca109细胞系的生物学行为抑制的研究目的探讨RUNX3基因表达与食管鳞癌患者的临床相关性的关系以及食管鳞癌细胞系Eca109过表达RUNX3后体外和体内的生物学行为改变。方法免疫组织化学检测食管鳞癌患者RUNX3的表达与其淋巴结转移的临床相关性,构建并用RT-PCR和Western-blotting检验稳定过表达RUNX3的Eca109细胞系。细胞免疫荧光染色鉴定RUNX3蛋白的定位。CCK-8、细胞划痕试验被用来确定Eca109细胞的增殖情况。TUNEL实验是分析过表达后细胞的凋亡。Iranswell侵袭实验对比检测细胞的侵袭能力。通过裸鼠成瘤实验分别验证过表达前后体内肿瘤生长的能力。结果相比在食管癌周围的正常食管上皮组织,RUNX3蛋白在食管鳞癌中表达较低。证实在食管组织中RUNX3的表达与食管鳞癌淋巴结转移显着相关(LNM)(P<0。01)。我们成功构建并验证了稳定过表达RUNX3的Eca109细胞系,发现RUNX3过表达能抑制细胞增殖,迁移和侵袭,并且诱导Eca109细胞的凋亡。在裸鼠体内实验中显着地抑制Eca109细胞的致瘤性。结论人类食管鳞癌组织RUNX3表达与ESCC进展显着相关。RUNX3的过表达显着抑制ESCC细胞增殖、迁移、入侵和致瘤性。验对比检测细胞的侵袭能力。通过裸鼠成瘤实验分别验证过表达前后体内肿瘤生长的能力。结果相比在食管癌周围的正常食管上皮组织,RUNX3蛋白在食管鳞癌中表达较低。证实在食管组织中RUNX3的表达与食管鳞癌淋巴结转移显着相关(LNM)(P<0。01)。我们成功构建并验证了稳定过表达RUNX3的Eca109细胞系,发现RUNX3过表达能抑制细胞增殖,迁移和侵袭,并且诱导Eca109细胞的凋亡。在裸鼠体内实验中显着地抑制Eca109细胞的致瘤性。结论人类食管鳞癌组织RUNX3表达与ESCC进展显着相关。RUNX3的过表达显着抑制ESCC细胞增殖、迁移、入侵和致瘤性。第二部分RUNX3基因阻抑食管鳞癌细胞生长的分子机制目的探讨RUNX3过表达及沉默后食管鳞癌细胞生物学行为及RUNX3与MMP-9, TIMP-1, ICAM-1之间的关系。方法采用免疫组织化学染色检查90例食管鳞状细胞癌标本RUNX3表达以及探讨RUNX3的表达与食管鳞癌阶段的相关性。通过构建稳定过表达RUNX3及沉默RUNX3的食管鳞癌细胞系,验证RUNX3的改变与MMP-9, TIMP-1和ICAM-1表达作用的关系。结果我们发现降低ESCC组织中RUNX3表达与肿瘤的T分期显着相关(P<0。01)。体外实验中沉默RUNX3导致促进Eca9706细胞生长,细胞迁移和侵袭。并且RUNX3的降低调节MMP-9和ICAM-1在食管鳞癌细胞中的表达。相反,在RUNX3过表达Kyse150细胞系中MMP-9, ICAM-1显着减少。结论研究表明,食管鳞癌中RUNX3的表达与食管鳞癌的发展显着相关。恢复RUNX3的表达显着抑制ESCC细胞迁移、侵袭和肿瘤发生,这可能是由于RUNX3与MMP-9 ICAM-1的表达有关,RUNX3在食管鳞癌中可能是一个潜在的治疗目标。结论研究表明,食管鳞癌中RUNX3的表达与食管鳞癌的发展显着相关。恢复RUNX3的表达显着抑制ESCC细胞迁移、侵袭和肿瘤发生,这可能是由于RUNX3与MMP-9 ICAM-1的表达有关,RUNX3在食管鳞癌中可能是一个潜在的治疗目标。第三部分5-氮杂胞苷对食管癌细胞生物学行为影响及其机制探讨目的探讨去甲基化试剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azac)上调RUNX3;基因表达后,食管癌Eca109细胞生物学行为的改变。方法体外培养的Eca109细胞,应用10、20和50μmol/L较低浓度的5-氮杂胞苷干预72h,实时定量PCR及蛋白质印迹法检测RUNX3基因的mRNA及蛋白表达水平改变,甲基化特异性PCR检测RUNX3基因的甲基化程度变化,细胞划痕、Transwell实验观察Eca109细胞迁移及侵袭能力的改变。结果经10、20和50μmol/L 5-氮杂胞苷干预72h后,RUNX3基因的mRNA表达水平分别增加2.18±0.23、4.57±0.26和6.90±0.36倍,RUNX3蛋白表达相对系数分别为0.196±0.004、0.278±0.013和0.396±0.025。Eca109细胞经5-氮杂胞苷处理后,部分RUNX3基因去甲基化。0、20和50μmol/L 5-氮杂胞苷干预72h后,RUNX3基因的去甲基化条带亮度值比值分别为0.125±0.003、1.791±0.112和2.987±0.236(P<0.001)。0、10、20和50gμmol/L氮杂胞苷干预72h后,Eca109细胞运动至划痕处细胞数分别为715±±20.1、398士19.3、302±16.4和124±-13.8。相比于对照组,10、20和50μmol/L干预组迁移细胞数百分率分别为62%、46%和12%,侵袭细胞数百分率为60%、45%和8%。结论较低浓度5-氮杂胞苷通过去甲基化途径上调人食管鳞癌Eca109细胞的RUNX3基因表达,并抑制Eca109细胞迁移、侵袭及体内增殖