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研究蛋白质-药物小分子相互作用、探讨二者作用行为与药物微观结构性质关系,可为药理机制阐述、药代动力学研究提供重要信息,对药物开发也有重要理论指导意义。唾液是血液超滤物,其内含物与血液相应成分密切相关。唾液药物与血液游离药物浓度相当,能近似反映药物有效治疗浓度。建立高灵敏唾液药物含量分析测定方法,对无损治疗药物监测、唾液药代动力学研究有重要意义。本论文以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为模型蛋白,选择三类临床广泛应用抗生素药物(大环内酯、四环素和磺胺类)和diphacinone (DPN)等共19种小分子为研究对象,采用流动注射化学发光分析(flow injection chemiluminescence analysis, FI-CL)和分子对接(molecular docking)的方法,研究了BSA与小分子相互作用,给出作用参数(结合常数K、结合位点数n)和热力学参数(ΔH, ΔS, AG),并讨论了BSA-药物作用行为与药物分子结构性质关系；以无损采样方式,进行了人体唾液罗红霉素、克拉霉素药代动力学的FI-CL研究,得到吸收速率常数ka、消除速率常数ke、消除半衰期t1/2及总表观消除速率Cltotal等代谢动力学参数。本论文包括三个部分：第一部分绪论第一章：以近五年所发表的研究论文254篇为基础,总结了蛋白质-小分子尤其药物相互作用研究意义和研究现状；介绍了常用模型蛋白、小分子、研究方法及数学模型；概述唾液药代动力学实用价值和应用现状；给出本论文研究背景,提出本论文研究思路和内容。第二部分研究报告第二章：BSA－抗生素类药物相互作用FI-CL研究1.实验发现BSA能加速鲁米诺(luminol)激发态电子转移速率,显著增敏luminol化学发光,据此建立luminol-BSA化学发光体系。实验表明大环内酯、四环素和磺胺三类药物均猝灭该体系化学发光,发光强度降低值与药物浓度符合定量通式：△I=AlogCantibiotic+B(r>0.99, Cantibiotic:1.0～5000pmol·L-1),发光强度猝灭率按红霉素ERY、吉他霉素KIT、麦迪霉素MID、交沙霉素JOS、琥乙红霉素ERE、丙酸交沙霉素JOP、醋酸麦迪霉素MIA、四环素TET、土霉素OXY、金霉素CHL、磺胺SNM、磺胺脒SGD、磺胺嘧啶SDZ、磺胺二甲嘧啶SMZ次序单调递增。2.以本研究组构建蛋白质-小分子相互作用FI-CL模型为基础,得到BSA-药物相互作用参数(K:103～105L·mol-1,n:约为1.0),随着药物尺寸的减小,K值呈规律性变化：大环内酯类药物<四环素类药物<磺胺类药物。分析发现大环内酯类药物R1～R4位-OH酯基化、四环素类药物R1～R2位为-Cl或-OH取代、磺胺类药物R1位-C(=NH)NH2基团均使K值增大。热力学参数结果(ΔH:-40.67～28.04kJ·mol-1:ΔS:-33.34～189.40J·mol·L-1;ΔG:-33.82～-18.35kJ·mol-1)表明BSA与三类药物相互作用自发进行,主要作用力分别为疏水作用、氢键和范德华力、静电作用。3.分析发现logK随测定灵敏度因子A、截距B增大而增大,相关系数r>0.98,并首次定义B为猝灭程度因子。K值与药物分子尺寸(分子质量MW、摩尔体积MV)／立体特性(摩尔折射率MR、极化率POL)/疏水性(分配系数logP、生物浓度富集因子logBCF、分布系数logD)关系探讨表明BSA-药物作用行为与药物物化参数密切相关。第三章：BSA-抗生素类药物相互作用分子对接研究分子对接分析表明BSA subdomain IIA空腔为三类药物的作用位点。结果表明：大环内酯类药物R1～R4位酯基与BSA有明显疏水作用,四环素类药物R1～R2位-Cl、-OH能诱发氢键形成,磺胺类药物R1位基团差异影响其在作用位点的立体构象。此外,AG(-33.24～-18.75kJ·mol-1)和K(1.93×103～6.68×105L·mol-1)接近FI-CL实验结果值,同样遵循：ERY<KIT<MID<JOS<ERE<JOP<MIA<TET<OXY<CHL<SGD<SDZ<SMZ.第二、三章工作已发表在RSC Advances(2013,doi:10.1039/C3RA45885G)。第四章：唾液罗红霉素、克拉霉素代谢动力学研究1.基于罗红霉素/克拉霉素猝灭luminol-BSA体系化学发光,由FI-CL模型得到K(106L·mol-1水平)和n(≈1.0),分子对接结果表明作用位点位于BSA subdomain IIA,均以疏水作用为主。2.连续监测健康志愿者单剂量口服150mg罗红霉素或250mg克拉霉素唾液药物24h含量变化(回收率：90.9%～110.1%,RSDs<6.4%,n=7),获得罗红霉素／克拉霉素代谢动力学参数(ka:0.97±0.18/0.058±0.006h-1、ke:0.082±0.010/0.15±0.01h-1、 t1/2:8.56±1.11/4.66±0.08h及Cltotal:1.90±0.22/8.26±0.18L·h-1等),与文献报道血液测定结果基本相符。本工作分别发表在Applied Spectroscopy(2013,67:54-58)和Applied Biochemistry and Biotechnology (2013, doi:10.1007/s12010-013-0605-4).第五章：luminol-BSA发光体系的分析应用1.以阿奇霉素/DPN猝灭luminol-BSA体系化学发光为基础,采用FI-CL和分子对接研究了BSA-阿奇霉素/DPN相互作用,结果表明阿奇霉素、DPN均能进入BSAsubdomain ⅡA, K、n分别为9.50×106/8.85×105L·mol-1、0.97/0.77,主要作用力为疏水作用。本法用于注射针剂、人血清模拟样阿奇霉素测定(回收率：91.3%～103.9%,RSDs<2.5%,n=5)、人血清/胃液模拟样DPN测定及DPN水溶液43h光照含量变化监测(回收率：91.8%～114.3%, RSDs<5.0%, n=5).本工作分别发表在Spectrochimica Acta Part A (2011,79:232-235)和Journal of AOAC INTERNATIONAL (2013, in press).2.基于甲醛增敏luminol-BSA体系化学发光,构建蛋白质-小分子相互作用FI-CL模型修正式log[(I-I0)/I0]=nlog[D]+logK,计算得到K (1.89×106·mol-1)、n (0.86)。采用分子对接给出结合位点和关键氨基酸残基。本法用于甲醛溶液分压、空气及啤酒甲醛含量测定(回收率：90.7%～109.3%, RSDs<4.5%, n=7)。本工作发表在Journal of the Chinese Chemical Society (2013, doi:10.1002/jccs.201300231)。第三部分总结第六章：总结本论文研究工作特色和创新点