棉花(Gossypium L.)是一种重要的经济作物,具有明显的杂种优势。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)不仅是植物杂种优势利用的基础,而且也是细胞质遗传、核质互作、细胞质对植物小孢子发育影响、环境对线粒体表达调控以及物种进化等遗传学研究的好材料。棉花花药发育涉及在孢子体和配子体组织中表达的多种基因的相互作用。然而,目前的研究只发现了少量的具体参与花粉发育过程的基因,而对于雄性不育的分子机理更是知之甚少。植物雄性不育的利用,促进了采用转录组与蛋白质组分析相结合来研究花药的发育。在本研究中,我们以晋A细胞质雄性不育系及其同核异质保持系在小孢子败育关键时期的花蕾为研究材料,将采用新一代测序技术的转录组研究(NGS)和采用双向凝胶电泳和质谱技术的蛋白质组研究相结合,对棉花CMS不育系JA及其同核异质保持系JB花药发育的差异表达基因和蛋白质进行综合研究,旨在找出与雄性不育相关的关键基因和途径。研究结果如下:1、本研究中,我们首次进行了棉花细胞质雄性不育系JA及其保持系JB在造孢细胞时期和小孢子母细胞时期的花蕾转录组分析,通过测序获得了2.8×107个reads,组装成的86093个基因(unigene),平均长度为755bp。2、对所获得的unigene进行生物信息学分析:(1)利用Nr、Nt、KOG、Swiss-Prot、KEGG和GO数据库进行基因功能注释;(2)根据NR、SwissProt、KEGG GENES的优先级顺序将unigene与以上蛋白库作blastx比对,根据最佳比对结果确定了36257个unigene的ORF读码框,并根据标准密码子表确定其CDS及编码的氨基酸序列;将与以上数据库比对不上的unigene用estscan(3.0.3)软件预测其CDS序列,共有28323个基因得到预测;(3)本研究共检测到518108个SNP位点、38345个Indel位点和17460个SSR基因位点,为开发标记设计了16496对PCR引物;(4)对不育系JA和保持系JB在花粉发育的造孢细胞和小孢子母细胞时期的基因表达数进行统计,并对不同材料在花粉发育的同一阶段以及同一材料在花粉发育的不同阶段的基因表达量进行了分析。结果显示:在花粉发育的两个阶段,分别有5457(SS)、3178(MS)和3608(SS)、3999(MS)个基因分别在JA和JB中差异表达。与保持系相比较,JA-CMS在造孢细胞时期共检测到709个差异表达基因,其中上调表达的基因293个,下调表达的基因416个;在小孢子母细胞时期共644个差异表达基因,其中上调表达的基因263个,下调表达的基因381个;JA在花粉发育的两个不同阶段(B3与B2)相比,差异表达基因共有17个,其中上调表达的基因有8个,下调表达的基因有9个;jb在花粉发育的两个不同阶段(k3与k2)相比,差异表达基因共有38个,其中上调表达的基因有29个,下调表达的基因有9个;(5)通过对dge进行层次聚类,k-means聚类和som聚类结果进行分析,发现ja细胞质雄性不育与能量代谢相关基因、碳水化合物代谢相关基因、转录因子、氨基酸代谢相关基因和信号转导相关基因可能相关;(6)对dge进行go和kegg富集分析,发现ja不育系与保持系相比,在ja花药发育的造孢细胞时期和小孢子母细胞时期的花蕾中氧化还原酶和双加氧酶活性下降,而与光合作用和黄酮类化合物的合成相关基因则更多地表现为上调表达。3、随机选取7个差异表达基因,应用荧光定量pcr对其进行表达模式验证,结果表明尽管实时定量pcr分析差异基因在表达量上有些差异,但基因总的表达趋势与转录组测序的结果完全一致。4、采用酚提取法分别提取棉花细胞质雄性不育系ja和保持系jb在造孢细胞时期和小孢子母细胞时期的花蕾总蛋白质。在对花蕾组织2-de电泳优化的基础上,采用18cm、ph3-10nl的ipg预制胶条,800ug的蛋白上样量,考马斯亮蓝染色,获得高清晰度和分辨率的蛋白质表达图谱,为棉花蛋白质组学的研究奠定了实验基础。5、不育系与保持系在花药发育的两个阶段棉花花蕾蛋白质组均得到了重复性好的凝胶图谱,pdquest8.0.1软件分析表明,不育系ja在花药发育的造孢细胞时期(b2)和小孢子母细胞时期(b3)的花蕾总蛋白斑点数分别为1505和1540;保持系jb在花药发育的造孢细胞时期(k2)和小孢子母细胞时期(k3)的花蕾总蛋白斑点数分别为1554和1540。这些蛋白质斑点的分子量分布在10-100kda,等电点分布在3-10。6、通过对棉花ja-cms和保持系造孢细胞时期和小孢子母细胞时期花蕾蛋白质组的差异定量研究和质谱分析,共鉴定了15个在两系间显著差异表达的蛋白质。用mascot搜索ncbinr绿色植物蛋白质数据库,并进行kegg和go功能分析。这些蛋白质分别参与能量代谢(3)、碳水化合物代谢(3)、碳代谢(3)、蛋白质和氨基酸代谢(1)、以及类脂(化合物)代谢(1)、花粉发育(1)、应激反应(1)、脂肪酸代谢(1)和一个线粒体上未知功能蛋白,分别位于线粒体、叶绿体、细胞核和膜上。7、棉花花药的发育是细胞中多个基因组相互作用、多条代谢途径的基因差异表达的结果。转录组和蛋白质组相结合的系统生物学研究方法将候选差异蛋白质和候选差异转录本相结合,可以更直接地反映这些基因产物的表达丰度和功能。差异表达蛋白质结合差异表达转录本的鉴定为全面解析cms提供了一条有效的研究方法。8、研究分析了线粒体基因的rna编辑,采用atp4、atp6、atp8、atp9和coxⅠ等5个基因的特异引物对JA-CMS及其保持系和恢复系进行PCR扩增,对所获得基因进行不育系、保持系、恢复系DNA序列比对,并且对atp4、atp9、atp8和coxⅠ基因的不育系与保持系cDNA序列进行RNA编辑分析。结果表明与其它双子叶植物相比,棉花atp4、atp8和atp9基因的RNA编辑具有保守性,而coxⅠ基因具有更多的编辑位点,并且认为coxⅠ基因的编辑不完全与雄性不育的产生相关。