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RNA干扰作用(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默,主要是指dsRNA分子进入细胞内,特异性降解与之同源的mRNA,从而特异高效地抑制相应基因表达的现象。为建立稳定的RNAi系统,本论文选择不同类型的启动子构建针对RED(红色荧光)基因的RNA干扰载体,并在HeLa细胞中验证本系统的可行性,为实现组织特异RNA干扰提供了技术支持,并且提供了一个生产转基因毛用动物的新思路。一RNA干扰载体的构建利用PCR方法分别从pcDNA3.1(+/-)载体克隆CMV启动子,从pGL3-K5质粒克隆角蛋白5(Keratin5,K5)基因启动子,从绵羊cDNA克隆角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein6.1,KAP6.1)基因启动子,从小鼠基因组扩增超高硫蛋白(Ultra-high-sulfur Keratin Protein,UHS)基因启动子,经pMD19-T载体连接,构成中间载体。同时将中间载体和pGenesil-1载体进行双酶切,纯化回收,连接,转化。克隆到与目的片段大小相一致的CMV启动子、K5、KAP6.1和UHS基因启动子(大小分别为660bp.870bp.1052bp和580bp)。成功构建了CMV-pGenesil-1、K5-pGenesil-1、 KAP6.1-pGenesil-1和UHS-pGenesil-1过渡载体。从3个shRNA表达载体上克隆得到shRNA目的片段,将扩增得到的目的片段与构建成功的过渡载体同时进行酶切、纯化回收、连接、转化。成功扩增到3个shRNA目的片段,大小分别为115bp.116bp和117bp,并将其与构建的过渡载体连接。经测序分析后,结果显示成功构建了15个针对RED基因的RNA干扰载体。二干扰载体表达的检测为验证构建的15个针对RED的干扰载体在HeLa细胞中是否能抑制RFP(红色荧光蛋白)的表达。将15个干扰载体分为6组转染HeLa细胞,每组转染实验重复4次,以只表达红色荧光的CMV-Red质粒作为对照组,转染48h后,荧光显微镜下观察RFP的表达变化,并利用RT-PCR与荧光定量PCR技术检测抑制效率。结果显示与对照组相比,15个干扰载体都产生了干扰作用,其中抑制效率最高的达90%以上。将K5驱动的shRNA1干扰载体转染进稳定表达红色荧光的绵羊成纤维细胞内,转染48h后,荧光显微镜下检测红色荧光和绿色荧光的表达。绵羊胎儿成纤维细胞中检测到绿色荧光的表达,表明干扰载体转染进绵羊胎儿成纤维细胞内；红色荧光的表达有所下降,表明K5驱动的RNA干扰载体产生了抑制作用。