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流行性乙型脑炎是一种危害严重的人畜共患传染病,其病原体为乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)。JEV以猪为重要扩增和贮存宿主,成为现代化养猪场中广泛存在的传染性病原之一,阻碍了我国生猪养殖业的发展。长远来看,寻找病毒复制宿主依赖因子,利用遗传学手段培育抗病新品种猪能够从本质上提高猪对病原的抵抗能力。前期本实验室利用猪的全基因组CRISPR/Cas9文库,在JEV感染MOI为0.03的条件下进行高通量筛选,鉴定到一批可能参与JEV复制的宿主因子。本研究针对其中的118个候选宿主因子,进一步设计和构建了一个聚焦型CRISPR敲除文库。随后,通过慢病毒策略构建了突变体细胞库,并依次采用不同MOI的JEV感染每轮存活的文库细胞,结合高通量测序技术与生物信息学策略筛选不同MOI的JEV感染条件下的候选基因。接着通过CRISPR/Cas9技术制备候选基因的敲除细胞系,结合病毒空斑实验、间接免疫荧光、绝对定量PCR及透射电镜检测等方法,评估敲除候选基因对JEV在PK-15细胞中复制的影响。进一步,利用RNA-Seq技术探索敲除候选基因EMC3抑制JEV在宿主细胞中复制的机制。获得如下研究结果:(1)设计并构建了一个针对JEV复制相关候选因子的聚焦型CRISPR敲除文库。该文库包含1000条sg RNA,除63条不靶向任意基因组的阴性对照sg RNA外,剩余的936条sg RNA分别靶向猪的74个蛋白编码基因和44个Linc RNA,其中有116个候选因子含有8条sg RNA。通过高通量测序技术分别评估sg RNA质粒文库和突变体细胞库的质量发现,其sg RNA覆盖度均在99.1%以上,且95%以上的sg RNA频率差异在10倍以内。表明构建的聚焦型CRISPR敲除文库质量较高。(2)依次采用MOI为0.03,0.5和1的JEV感染每轮存活的文库细胞,采用高通量测序技术与生物信息学策略筛选不同MOI的JEV感染条件下的候选基因,发现随着病毒MOI的提高,内质网相关蛋白编码基因富集程度逐渐增强。结合GO分析和KEGG分析发现,内质网的蛋白质折叠信号通路中EMC3、EMC6、SEC63、CALR和UBE2J1富集。由此,选择其中的3个内质网相关蛋白编码基因EMC3,EMC6和SEC63作为候选基因开展功能鉴定。(3)利用CRISPR/Cas9技术靶向EMC3,EMC6和SEC63各制备了2株基因型不同的基因敲除细胞系。采用Sanger测序发现候选基因敲除细胞系的基因组DNA序列均发生移码突变,Western Blot检测显示2株EMC3基因敲除细胞系中对应的目的蛋白完全缺失表达。进一步利用间接免疫荧光和RTCA技术检测发现分别敲除3个内质网相关蛋白编码编码基因不干扰细胞的正常增殖。(4)开展敲除EMC3,EMC6和SEC63基因的抗JEV表型验证。利用倒置荧光显微镜和实时无标记细胞功能分析(RTCA)技术监测发现,JEV(MOI=1)感染的野生型细胞全部死亡时,候选基因敲除细胞系生长状态良好。通过空斑实验、绝对定量PCR、间接免疫荧光及Western Blot检测发现,受JEV(MOI=1)感染时,候选基因敲除细胞系中的病毒滴度、JEV的拷贝数和JEV编码NS3蛋白的表达水平均低于同一时间点的野生型细胞组。表明敲除3个内质网相关蛋白编码编码基因不仅能显著抑制JEV在宿主细胞中的复制,而且能够显著抵抗病毒诱导的细胞死亡。(5)利用透射电镜观察内质网的形态发现,受JEV(MOI=1)感染时,EMC3基因敲除细胞系的内质网腔中未观察到JEV粒子,但内质网形态发生不规则变化。表明敲除EMC3可能通过改变内质网形态来抑制JEV的复制。(6)利用RNA-Seq技术检测EMC3基因敲除细胞系受JEV感染前后其转录组水平的变化发现,JEV感染EMC3基因敲除细胞系引起大量基因差异表达。进一步采用GO和KEGG功能富集分析发现,EMC3基因敲除细胞系未受JEV感染时,参与内质网跨膜转运过程的基因差异上调表达,受JEV感染时这些基因差异下调表达。推测敲除EMC3可能通过降低内质网的跨膜转运功能抑制JEV的复制。进一步,利用reactome数据库进行信号通路分析发现,与野生型细胞相比,EMC3基因敲除细胞系受JEV感染时,5个与内质网应激反应相关的信号通路差异下调。推测敲除EMC3可能通过降低内质网应激反应抑制JEV的复制。本研究基于聚焦型CRISPR敲除文库筛选技术,鉴定了内质网相关蛋白编码基因EMC3,EMC6和SEC63为JEV复制宿主因子,发现敲除EMC3可能通过改变内质网形态来抑制JEV的复制,敲除EMC3可能通过调控细胞内质网跨膜转运功能或内质网应激反应抑制JEV的复制,为解析JEV的致病机制提供理论基础,为基因编辑抗病猪的培育提供了新的靶点。