研究背景 细胞在新陈代谢和完成各种生理功能过程中，不断面临着细胞内外渗透活性分子在细胞内外的流动，从而不断产生细胞内外渗透压的变化，使细胞处于不断变化的渗透梯度中。由于细胞对水的自由通透性，水分会依据渗透梯度通过渗透或水通道流入或流出细胞，从而产生细胞容积的变化。可见既使在正常生理条件下，细胞的容积也处于不断的变化中，与此相适应，许多细胞进化了自身的细胞容积调节功能，即当细胞受到非等渗刺激而产生容积增大或缩小时，细胞自身会通过调节机制使变化了的细胞容积向正常体积恢复。细胞的容积调节功能在细胞的免疫应答、细胞的迁移、细胞的增殖与分化过程中具有十分重要的意义。 细胞的容积调节功能主要包括两种：一种为调节性细胞容积增大（regulatory volume increase，RVI），指当细胞受到高渗透压的刺激而皱缩后，细胞能够调节性的使已经皱缩的细胞体积向正常体积恢复；另一种为调节性细胞容积减小（regulatory volume decrease，RVD），指当细胞受到低渗透压的刺激而膨胀后，细胞能够调节性地使已膨胀的细胞体积向正常体积恢复。 由于RVD功能与细胞的各项生理功能密切相关，所以许多学者致力于RVD的研究。在小肠上皮细胞，由于其功能的特殊性，经常地处于不断变化的渗透压环境中，RVD功能就显得尤为重要。关于RVD现象的观察已有许多报道，证实大多数哺乳类细胞均具有RVD功能，仅有极少数细胞没有RVD功能，且 第。军医大磅傅士磅值公大 一 己发现在 RVD过程中有广和o”离子的跨膜流动，即 K“通道和 CI”通道的开放。 关于小肠上皮 itestine 407细胞的 RVD过程及其对钙的依赖性 Okada研究室17‘］ 己做了报道，但关于RVD过程中参与的离子通道的分子亚型，电生理学特点 还未见详细报道，尤其是关于小肠上皮 Intestine 407细胞 RVD过程中激活的 K” 通道的研究仍为空白，本文的研究有助于填补这项空白，并为近一步阐明RVD 的机制和为临床疾病治疗与药物应用提供了可靠的依据。 研究目的 将分子生物学、电生理膜片钳技术和细胞容积测定方法有效地结合，对小 肠上皮 Intestine 407细胞 RVD过程中激活的离子通道尤其是 K”通道在基因和功 能两个水平进行研究。具体包括：1．记录RVD时细胞膜上的电流变化，分析 通道电流特性；2．记录容积敏感性、外向整流性氯通道（VSOR）的电流，分 析其电生理学和药理学特性：3．分子生物学确定 Intestine 407细胞有无钙激活 性广通道m NNA的表达及其表达亚型：4．研究1n比幻he407细胞钙激活性义 电流全细胞和单通道的电生理特性，判断其分子亚型；5．观察 Intestine 407细 胞 RVD的过程中激活的 K＋电流特性，确认其通道亚型；6．观察各通道在 RVD 过程中的作用。 研究内容和方法 采用的方法和具体研究内容如下：1．1n比shne407细胞的培养：2．采用 反转录聚合酶链式反应（RTPCR）法，互补 DNA…DNA) 3’端快速扩增法和 cDNA 5’端快速扩增法，从 Intestine 407细胞上检测钙激活性 K”通道各亚型的表 达；3．膜片钳全细胞记录细胞调节性容积减小时激活的Q”电流和K“电流的变 化；4．分析O”电流的电生理学和药理学特征；5．观察Intestine 407细胞钙 激活性K”通道的全细胞与单通道特性；6．检测RVD所激活的K”通道的钙依赖 性和其单通道特征，验证 RVD所激活的 K＋通道即为钙激活性 K＋通道；7．直接 测定细胞的RVD过程，观察各离子通道阻断剂对RVD的影响作用，进一步证 明电生理学实验的结果；8．采用Pulsefit and Pulsemate采样并转换数据库， Oropn 6刀进行数据处理分析。 一3一 第四军医大穆傅女管值公大 一 研究结果 1．小肠上皮Intestine 407细胞在低渗KCI溶液中，细胞体积增大，全细胞膜 片钳方法可以分别记录到K“和Q”电流的激活。 2．小肠上皮Intestine 407细胞在无K”低渗＊“溶液中，可以分离记录RVD时 激活的＊”电流，应用＊”通道阻断剂disothio－cyanostibibene－2，2－isulfonic acid （DIDS 00 pM），5－nitro－2－（3－phenylprophlalnino）七enzoate yPPB 00 pM)和 根皮素叩hloretin)口00卜M)可以明显抑制 RVD时激活的o电流。 3．小肠上皮Intestine 407细胞在无口“低渗K”溶液中，可以分离记录RVD时 激活的 K”的全细胞电流，用克霉哇（CLT spM）可以明显抑制该 K”电流，在电 极内液加入 BAPTA6 mM?