番茄叶绿体抗氧化酶基因的克隆与遗传转化的研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dongyu661
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植物体内产生的活性氧能被超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶清除。超氧阴离子自由基在SOD的催化下,通过歧化反应产生H2O2。抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种清除H2O2的关键酶,它对于保护叶绿体和其它细胞组分免受H2O2及其所产生的羟基自由基的破坏是必不可少的。 本文以抗冷性不同的两个番茄品种(系)为试材,测定了低温胁迫下抗氧化酶活性,克隆了番茄叶绿体APX 和Cu/Zn-SOD基因,并转化烟草,为探讨活性氧在低温胁迫下的作用性质,寻找提高番茄逆境光合能力的有效途径和方法提供理论依据。主要研究结果如下:1. 研究了低温(4℃)胁迫对抗冷性不同的两个番茄品种(系)抗氧化酶的活性影响。在低温处理的最初4 h,番茄叶片的SOD、APX、POD活性均上升。SOD、APX、CAT活性分别在处理的6 h、6 h、2 h时达到峰值,然后下降。在低温胁迫初期,抗冷性较强的番茄品种L402的酶活性上升速度明显快于中杂7号,而达峰值后酶活性的下降明显慢于中杂7号。POD活性则随低温处理时间延长而持续增强。2. 根据其它植物已知的类囊体膜APX的氨基酸保守序列设计兼并引物,以抗冷性较强的L402低温处理6 h的叶片为材料,利用RT-PCR法得到了一个约405bp的基因片段。经测序和BLAST分析表明,该片段与其它植物类囊体膜APX基因具有较高的同源性,是番茄类囊体膜APX基因片段,并在GeneBank登记(AF413573)。3. 根据获得序列设计引物进行3’和5’RACE-PCR,并进一步获得番茄类囊体膜APX基因的全长。4. 从低温处理6 h的番茄品种L402的叶片中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Cu/Zn-SOD的cDNA,所克隆的Cu/Zn-SOD cDNA序列全长为962bp,编码217个氨基酸。用GenBank中的BLAST进行序列分析,该序列与菠菜、豌豆、拟南芥Cu/Zn-SOD的同源性分别是82%、82%、80%。说明已经获得了番茄品种L402的叶绿体Cu/Zn-SOD序列,并在GenBank注册(AF527880)。把获得的APX基因与含35S启动子的pBIH载体重组,构建了正义表<WP=6>5. 达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草。检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。
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