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结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）是十字花科芸薹属绿叶蔬菜,在我国蔬菜供应中占有重要的地位。结球甘蓝品种选育主要依赖于杂种优势利用,自交不亲系和雄性不育系利用是杂种一代品种选育的主要手段。两种方法选育杂种一代都依赖于大量优良自交系的获得。通过突变方式创制优异种质资源是自交系改良的重要手段。除了天然突变方式获得突变体外,通过物理或者化学方法人工创制突变体是最为常见的方式,这些诱变方式虽较天然突变效率高了很多,由于突变的随机性和不可控性导致获得理想突变体异常困难。近年来,基于生物方法获得突变体的定向突变方式先后出现,大幅提升了诱变的精确性和针对性。包括同源重组、巨型核酸酶、锌指核酸酶ZFNs、转录激活样效应因子核酸酶TALENs和成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR/Cas9等定向突变技术被先后用于植物的突变体创制。其中成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR基因编辑系统由于成本低廉,使用简便,构建较简单,迅速成为植物突变体创制的主流技术。另外,因Cas蛋白家族类型众多,识别位点变异丰富,利用不同的Cas蛋白家族成员构建基因编辑系统可以覆盖较多的基因区编码域,从而满足不同基因编辑需求。如Sp Cas9（PAM:5,-NGG-3,）、Sth1Cas9（PAM:5,-NNAGAAW-3,）、Sa Cas9（PAM:5,-NNGRRT-3,）、Nm Cas9（PAM:5,-NNNNGATT-3,）、Cj Cas9（PAM:5,-NNNNACAC-3,、5,-NNNNRYAC-3,）、Sc Cas9（PAM:5,-NNG-3,）、Df Cas9（PAM:5,-NNRNAY-3,）、Pp Cas9（PAM:5,-NNNNRTN-3,）、Ace Cas9（PAM:5,-NNNCC-3,）等基因编辑系统,基于这些不同Cas蛋白构建的基因编辑系统在植物中均得到程度不同的应用。其中Sp Cas9系统是研究最为深入,应用最为广泛的基因编辑系统,其在甘蓝中对关于种子活力的PR55/B基因进行了功能验证;对PDS基因进行了高效的编辑;对开花位点FLC基因进行编辑得到了早花甘蓝。但Sp Cas9系统受到其识别PAM位点序列NGG的限制,单靠该系统无法满足不同基因编辑场景的要求。因此,需要寻找更多识别位点不同的Cas蛋白,拓宽靶标基因的编辑范围。电子科技大学植物基因组工程实验室通过数据挖掘和分析得到了来源于Lactobacillus spp.的Lac Cas9核酸酶系统,该系统优先识别PAM位点序列5,-NGAAA-3,,在水稻中实现了目标基因的突变,同时也发现该系统的编辑活性和效率受到温度的影响。为了研究该系统在不同物种中的编辑特征,扩大其应用范围,本实验在甘蓝和烟草中针对该系统进行了基因编辑和分析。研究结果如下:1、以甘蓝Bo BIK、Bo PDS、Bo GA基因为靶标基因测试了CRISPR/Lac Cas9系统的编辑特性。根据CRISPR/Lac Cas9系统优先识别5,-NGAAA-3,PAM位点的特征,选择甘蓝Bo BIK基因中以5,-TGAAA-3,PAM和5,-GGAAA-3,PAM位点、Bo PDS基因中以5,-GGAAA-3,PAM和5,-TGAAA-3,PAM位点、Bo GA基因中以5,-TGAAA-3,PAM和5,-CGAAA-3,PAM位点为依据设计两个靶位点sg RNA,分别构建p CA-LCas BIK-sg RNA01/sg RNA02、p CA-LCas PDS-sg RNA01/sg RNA02、p CA-LCas GA-sg RNA01/sg RNA02单转录编辑载体;上述载体通过农杆菌转化法转化甘蓝159材料获得转基因阳性植株,在基于MYB色素辅助阳性植株筛选及Lac Cas9基因PCR鉴定基础上,结果显示在25℃培养条件下,仅在64株Bo BIK-sg RNA01转化植株中检测到1个突变植株,显示CRISPR/Lac Cas9系统在这个位点上的编辑效率仅为3.0%。2、将各位点获得的部分阳性植株所对应的愈伤组织从25℃转29℃下培养,重新分化新的植株。其中在Bo BIK-sg RNA02位点获得的67株转基因植株中检测到5个突变植株,显示CRISPR/Lac Cas9系统在此位点的编辑效率为23.8%。在74株Bo PDS-sg RNA02中,有1株突变植株,CRISPR/Lac Cas9系统在此位点的编辑效率为16.7%。3、选择各靶位点获得的阳性植株的茎段重新置于29℃分化愈伤组织。结果在Bo BIK-sg RNA01靶位点处检测到1个突变事件,CRISPR/Lac Cas9系统在该位点的编辑效率为3.7%。在Bo PDS-sg RNA02靶位点有4个突变事件,CRISPR/Lac Cas9系统在此位点的编辑效率为13.3%。在Bo GA-sg RNA02靶位点发生了1例突变事件,CRISPR/Lac Cas9系统在此位点的编辑效率为12.5%。4、在甘蓝中,CRISPR/Lac Cas9编辑效率明显受到温度的影响,在29℃条件下进行转化愈伤的诱导及植株再生有利于提升其编辑效率;在各种5,-NGAAA-3,PAM序列识别序列中,其基因编辑靶位点偏好PAM序列为5,-GGAAA-3,。5、在烟草PDS基因中选择具有5,-NGAAA-3,PAM位点的8个靶位点,构建了两个p LCas-t PDS-ABCD/EFGH单转录编辑载体转化普通烟草,每个编辑载体转化的烟草分别在25℃、29℃条件下培养,将每个载体在25℃、29℃温度得到的各45株的阳性烟草植株中进行靶位点检测与分析。结果显示在所有的植株中均未检测到编辑事件发生。初步结果显示CRISPR/Lac Cas9基因编辑系统的编辑效率可能与作物种类有一定的关系。