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β-1,4-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一类从木聚糖主链的内部随机切割β-1,4木糖苷键的水解酶，简称木聚糖酶。近年来，随着人们对自然界半纤维素资源的开发和低聚木糖生理功能的发现，木聚糖酶获得了广泛的应用。宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) E001可产具高催化活性的中温木聚糖酶，为了进一步提高木聚糖酶的活力，并探讨其耐热机制，本论文克隆和表达了来自A. usamii E001的糖苷水解酶11家族(GHF11)木聚糖酶AusXyn11D及AusXyn11A的基因序列。并以具高比酶活的AusXyn11A为研究对象，通过分子动力学模拟的方法指导其N端替换，以改善其热稳定性，此外，还分析了杂合木聚糖酶的耐热机制及水解产物特性。以曲霉基因组中的木聚糖酶保守序列为基础，利用多种PCR技术获得A. usamiiE001木聚糖酶基因Ausxyn11D的完整cDNA和DNA序列，其GenBank登录号分别为JQ219105和HQ724287。氨基酸序列同源性分析结果表明AusXyn11D具有GHF11木聚糖酶高度保守的氨基酸片段及催化活性中心，且与A. usamii E001中两种已知的GHF11木聚糖酶的同源性分别为58%和37%。同源建模结果显示，AusXyn11D具有GHF11木聚糖酶典型的“右手”型结构，表明AusXyn11D属于GHF11木聚糖酶。依据Ausxyn11D的cDNA序列设计引物，利用RT-PCR技术克隆其成熟肽基因，同时根据GenBank中A. usamii E001GHF11木聚糖酶AusXyn11A的基因序列，扩增得到成熟肽基因Ausxyn11A，然后，成功构建毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115重组子GS115/Ausxyn11D及GS115/Ausxyn11A。经甲醇诱导表达后，重组木聚糖酶reAusXyn11D、reAusXyn11A的比酶活分别达到150.3U/mg和22,714U/mg； reAusXyn11D和reAusXyn11A的Topt分别为55℃和50℃，分别在50℃和45℃以下稳定，最适pH值均偏酸性，且pH稳定范围分别为3.5~6.5和4.0~8.0。但与reAusXyn11D相比，reAusXyn11A具有高比酶活的优点，因此具有重要的工业应用价值。此外，为了获得高产木聚糖酶的基因工程菌株，对GS115/Ausxyn11A的发酵条件进行优化，reAusXyn11A的酶活最高可达912.6U/mL，是优化前的2.14倍。对文献报道的耐热木聚糖酶EvXyn11TS基因序列进行毕赤酵母密码子优化，人工合成其优化基因Syxyn11，并在P. pastoris GS115中获得表达，重组木聚糖酶reSyXyn11的比酶活为363.2U/mg，Topt可高达85℃，并在80℃以下稳定，最适pH值为6.5，在pH4.5~9.0的范围内稳定，是目前最耐热的GHF11木聚糖酶之一。通过分子动力学模拟的方法分析AusXyn11A和EvXyn11TS的N端序列，确定用EvXyn11TS的Asn1-Arg38区域替换AusXyn11A中的Ser1-Ala33区域，以此构建杂合酶AEXynM。重组杂合木聚糖酶reAEXynM的比酶活为19,237U/mg，稍低于reAusXyn11A。reAEXynM的Topt为70℃，75℃以下稳定，较reAusXyn11A有显著性提高，其Tm值可高达91.6℃，虽略低于文献报道的EvXyn11TS的Tm值，但比reAusXyn11A提高了34.0℃，表明杂合酶的热稳定性大大提高了。采用分子动力学模拟的方法分析AEXynM与AusXyn11A中的差异氨基酸，并结合分子间作用力的分析，推测与AEXynM热稳定性相关的位点为Cys5、Pro9及His14，以此构建突变酶基因，获得重组突变酶reAEXynMC5T、reAEXynMP9S和reAEXynMH14N。三种突变酶的热稳定性均出现一定程度的下降，其中reAEXynMC5T的热稳定性最差，证实N端二硫键(Cys5-Cys32)的添加是AEXynM热稳定性提高的主要原因之一；而reAEXynMP9S和reAEXynMH14N则表现出相对微弱的下降，结构分析表明，Pro9可提高β-转角的刚性，而His14与Phe17可形成氢键，加固了β-折叠B1与B2之间的连接，是影响AEXynM热稳定性的重要因素。以玉米芯木聚糖及桦木木聚糖为底物，研究AEXynM的水解过程及产物，研究结果显示玉米芯木聚糖的水解产物以木二糖和木三糖为主，分别占水解产物总量的42.33%和38.76%；而桦木木聚糖的水解产物主要以木二糖为主，可占水解产物总量的58.56%；两种底物的水解液中仅有少量木糖被检出，表明其在低聚木糖制备方面具有极大的应用潜力。