背景脊髓缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, I/R injury)是一种常见的临床病理生理过程,无论是在脊髓本身的创伤还是在心胸外科、血管外科、脊柱外科等领域的医源性损伤或手术并发症中,I/R都扮演着非常重要的角色。脊髓I/R损伤可造成严重后果,并且目前的治疗效果欠佳。寻找新的预防和治疗脊髓I/R损伤的方法至关重要。对脊髓I/R损伤的机制探讨的缺乏是探索新防治方法的障碍之一。因此,进一步深入研究脊髓I/R损伤的机制有助于开拓新的研究思路。微小RNA (microRNA, miRNA)是近年发现的一类长度约为20-24个核苷酸的非编码的核糖核酸(RNA)分子,能抑制信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)的翻译从而调控蛋白质的表达。目前,已在哺乳动物的包括脑和脊髓在内的中枢神经系统(central nervous system, CNS)中发现多种miRNA的表达,这些miRNA参与了多种中枢神经创伤或变性疾病的病理生理过程。但是,尚不清楚miRNA在脊髓I/R损伤过程中是否发挥了重要的调控作用。他汀类药物对I/R损伤的保护作用已在脊髓、大脑、心脏、肺、肝脏、肾脏和肠等诸多组织器官中得到证实。但是,他汀类药物对促进脊髓I/R损伤后神经功能恢复的确切机制却鲜有报道,他汀类药物是否通过调控miRNA而发挥在脊髓I/R损伤中的神经保护作用是值得我们进一步探讨的。目的本研究旨在通过miRNA芯片技术探讨miRNA在脊髓I/R损伤大鼠模型中的表达及阿托伐他汀预处理对miRNA表达的影响,筛选差异表达的miRNA,从而进一步在细胞模型中进行验证,并深入探讨miRNA调节脊髓I/R损伤的确切机制。方法一.大鼠脊髓缺血再灌注损伤后microRNA表达改变及阿托伐他汀的干预作用探讨以阻断SD大鼠腹主动脉的方法建立大鼠脊髓I/R损伤的模型,18只大鼠分为三组,分别为：假手术组、手术组(只接受生理盐水)和药物组(阿托伐他汀10mg/kg/d预处理2周)。分别在再灌注6、12、24和48小时应用Basso Beattie Bresnahan (BBB)评分系统评价脊髓神经功能；采用hematoxylin-eosin (HE)染色,2,3,5,-triphenyltetrazolium chloride (TTC)染色明确神经细胞形态变化及损伤情况；miRNA芯片检测缺血再灌注脊髓组织miRNA表达谱；采用实时定量PCR进行验证。二.缺血缺氧再灌注对PC12细胞miR-146a表达的影响以氧糖剥夺再复氧复糖的方法建立PC12细胞I/R损伤模型,血气分析仪检测培养液pO2以评估缺氧系统效果；采用实时定量PCR方法分别检测对照组和缺血再灌注组(I/R组)白细胞介素1受体关联激酶1(IRAK1)和肿瘤坏死因子a (TNF-α)表达；分别在细胞缺血缺氧再灌注后0、24、48和72小时采用MTT法检测细胞增殖；并分别在6、12和24小时检测]miR-146a和miR-199a的表达。三。miR-146a调控PC12细胞缺血缺氧再灌注的机制探讨采用氧糖剥夺再复氧复糖的方法建立PC12细胞I/R损伤模型；转染miR-146a互补单链(抑制物)或miR-146a双链(模拟物,是一种增效剂),抑制或过度表达PC12细胞miR-146a的表达水平；分别在细胞缺血再灌注后0、24、48和72小时采用MTT法检测细胞增殖；采用生物信息学的方法预测SIKE1为miR-146a的靶基因,构建用于鉴定靶基因的报告基因载体,并与miR-146a模拟物共转染293T细胞后,检测报告基因中海肾荧光素酶相对活性；采用实时定量PCR检测IRAK1、IKKε抑制因子(SIKE1)mRNA的表达；采用western blot检测IκB-α和磷酸化IκB-α的表达。结果一.大鼠脊髓缺血再灌注损伤后microRNA表达改变及阿托伐他汀的干预作用探讨手术组各个时间点的BBB评分较假手术组显著下降,阿托伐他汀预处理后,在再灌注6、12、24、和48小时后BBB评分均较手术组明显改善；手术后48小时对缺血再灌注脊髓组织行TTC染色,对缺血面积行定量检测,手术组缺血面积显著大于假手术组(2.1±0.1.vs.77.3±5.1,P<0.01),阿托伐他汀干预后,与手术组相比,缺血面积显著缩小(43±3.2.vs.77.3±5.1,P<0.05)。在缺血再灌注48小时后采用芯片检测miRNA表达谱的改变。与假手术组相比,其中48种miRNA在缺血再灌注后表达明显改变,38种上调1.6-4.9倍,另有10个miRNA表达下调。采用10mg/kg/d的阿托伐他汀预处理后,与手术组相比,13种miRNA表达发生改变。其中,阿托伐他汀预处理可逆转缺血再灌注损伤后的8种miRNA,包括miR-365、miR-323、 miR-672*、miR-760-5p、miR-376b-5p、miR-369-5p、miR-210和miR-199a。二.缺血缺氧再灌注对PC12细胞miR-146a表达的影响1.经血气分析仪检测未缺氧的细胞培养液中的p02为87.36±2.58mmHg,而缺氧24小时的细胞培养液中的p02为37.63±0.78mmHg,与未缺氧的细胞培养液相比,p02下降约56.9%；2.PC12细胞经缺血再灌注处理24小时后,可观察到IRAK1mRNA表达明显升高,为对照组的3.95±0.25倍；同样,TNF-α mRNA表达明显升高,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)；3.分别在细胞缺血再灌注后0、24、48和72小时采用MTT法检测细胞增殖,对照组和I/R组在24小时细胞增殖最明显,同时,缺血再灌注可使细胞增殖受到明显抑制,在24、48和72小时分别下降17.8%、15.5%和12.9%；4.缺血再灌注损伤对miR-199a的表达无影响,相反,与对照组相比,miR-146a的表达显著升高,且与缺血缺氧的时间成正相关,缺血24小时组miR-146a的表达升高最为明显,为对照组的9倍。三.miR-146a调控PC12细胞缺血缺氧再灌注的机制探讨1.转染抑制物后,可见miR-146a表达在转染后48小时和72小时明显下降,分别为对照组的0.17±0.03、0.16±0.01倍(P值均<0.001)；在转染miR-146a模拟物后,可见miR-146a表达在转染后48小时和72小时明显升高,分别为对照组的26.1±3.01、26.5±3.02倍(P值均<0.001)；2.与阴性对照组相比,转染miR-146a抑制物后,IRAK1的表达明显升高,而转染miR-146a模拟物后,IRAK1的表达被抑制,且有统计学差异(P<0.05)；3.转染miR-146a模拟物后,磷酸化IκB-α的表达明显降低53%,而转染miR-146a抑制物后,磷酸化IκB-α的表达明显升高达3.12±0.25倍；4.转染miR-146a抑制物后,与阴性对照组相比,细胞增殖被抑制,分别在24小时和72小时最明显。转染miR-146a模拟物使miR-146a过表达后,可促进细胞增殖,在24小时最明显；5.双荧光素酶报告实验显示miR-146a能显著抑制含3’-UTR的SIKE1报告基因活性(P<0.05),而对含3’-UTR突变位点的SIKE1报告基因载体无抑制；6.与阴性对照组相比,转染miR-146a抑制物后,SIKE1的表达明显升高,而转染miR-146a模拟物后,SIKE1的表达被抑制,且有统计学差异(P<0.05)。结论1. miRNA参与了对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的调节,阿托伐他汀预处理可对大鼠脊髓缺血再灌注损伤发挥神经保护作用,其机制可能与其对miRNA的调控有关；2.在PC12细胞缺血再灌注损伤模型中,miR-146a的表达升高,且其程度与缺氧时间相关,在24小时表达呈高峰,提示miR-146a参与了PC12细胞缺血再灌注损伤的调控,但其具体的机制尚值得进一步的探讨；3. miR-146a可通过抑制IRAK1和NF-κB活性而改变TLR信号通路活性,调节PC12细胞缺血再灌注炎症反应；4. SIKE1为miR-146a的靶基因,miR-146a可能通过抑制SIKE1参与PC12细胞缺血再灌注后的增殖调控。