宫颈癌是世界范围内影响妇女的第二大癌症,尤其是在欠发达地区。宫颈癌具有高发病率和高死亡率的特点。因此目前迫切需要开发治疗宫颈癌的新型药物。天然药物具有多重优点,例如毒性小、多靶点、来源广等,因此从天然药物中筛选新型抗癌药物成为了研究热点。人参作为一种著名的传统药用植物,在亚洲地区已广泛使用了数千年,近期在西方国家越来越受欢迎。人参皂苷是人参中最重要的活性成分之一,具有抗肿瘤、调节免疫等作用。因此,本研究从多种皂苷中筛选出抗宫颈癌活性的人参总皂苷、Rg3和Rh2,并对其作用机制进行研究。目的:本研究以宫颈癌He La细胞为模型,筛选出对宫颈癌He La细胞有调控作用的人参皂苷,并探讨其在不同细胞培养条件下对细胞自噬和凋亡的影响及药效物质基础研究。方法:本研究利用CCK-8法考察人参皂苷对细胞活力的影响,确定人参皂苷给药浓度、作用时间;Hoechst 33342染色法、Annexin V/FITC-PI双染法考察人参皂苷对He La细胞的凋亡作用并利用流式细胞术对细胞周期进行分析;采用活性氧(ROS)测定和罗丹明123法检测细胞凋亡途径;利用Western blot和q RT-PCR技术,对凋亡和自噬相关蛋白和m RNA的表达水平进行检测;利用AO染色和自噬指示质粒转染检测自噬发生程度。结果:1.使用血清饥饿法诱导细胞自噬,对人参不同单体和总皂苷进行筛选,结果发现在无血清培养条件下,作用时间24小时,人参皂苷Rh2、Rg3和总皂苷均可以抑制He La细胞增殖,作用浓度分别为5μM、20μM和60μg/m L。2.人参总皂苷不可逆的增强HeLa细胞的自噬水平,包括促进AVO形成,EGFP-LC3聚集,以及自噬相关因子的表达,在放线菌素参与下,p62的降解也显著增加。人参总皂苷(0-120μg/m L)显著抑制饥饿条件下He La细胞的增值,自噬抑制剂3-MA能够部分回复这一抑制作用。同时,人参总皂苷下调细胞中BST-2的转录水平,说明人参总皂苷对He La细胞的影响是通过多种途径介导的。3.在无血清诱导的饥饿状态下,人参皂苷Rh2和Rg3调节HeLa细胞自噬水平,引起细胞AO染色变化,增加LC3 I-LC3 II的转变,EGFP-LC3荧光点的聚集,m RFP-GFP-LC3红绿荧光比率,抑制自噬底物p62的降解。并引起ROS增加,线粒体膜电位下降,凋亡诱导物AIF从线粒体释放,发生核转移,引发一系列后续的凋亡事件。自噬诱导剂rapamycin对人参皂苷Rh2和Rg3诱导的凋亡具有抑制作用,而自噬抑制剂BA1促进其诱导的细胞凋亡。因此,Rh2和Rg3通过调节自噬促进He La细胞凋亡。4.在正常细胞培养条件下,人参皂苷Rh2同时提高了宫颈癌Hela细胞的细胞凋亡率和自噬水平。人参皂苷Rh2通过显著降低线粒体膜电位,引起一系列凋亡相关因子的表达变化,从而诱导宫颈癌细胞发生凋亡。同时,人参皂苷Rh2也会提高自噬调控蛋白的转录和表达水平,促进自噬标志分子的剪切和聚集,通过AMPK/m TOR途径诱导细胞自噬。使用自噬诱导剂导致人参皂苷Rh2所诱导的细胞凋亡减少,而自噬抑制剂3-MA的引入则使其所诱导的细胞凋亡增加。同时,凋亡抑制剂Z-VAD-FMK在降低凋亡率的同时,也提高了细胞自噬水平。说明细胞凋亡和自噬两者联系紧密,互相影响。结论:1.人参皂苷Rh2和Rg3在自噬的晚期(即溶酶体与自噬体融合阶段)发挥作用,从而抑制细胞的自噬流,使细胞无法通过自噬来维持自身状态,失去了自噬与凋亡间的平衡,继而通过线粒体-AIF途径引起细胞凋亡。2.人参总皂苷能够引起细胞发生过度自噬发生自噬性死亡,同时降低了肿瘤细胞存活所必需的BST-2的转录水平,说明人参总皂苷对He La细胞的影响是通过多种途径介导的。3.在正常培养条件下,人参皂苷Rh2引起细胞凋亡的同时也通过AMPK/m TOR途径诱发保护性自噬。说明抑制自噬可能是提高Rh2效率的潜在治疗策略。