酿酒酵母通过出芽进行繁殖,出芽过程经历着细胞极性的建立与极性生长过程。Cdc42是酿酒酵母中调控细胞极性的中心分子,参与调控actin细胞骨架、septin组织和极性分泌等过程。Bem3是Cdc42的一个GTP酶激活蛋白（GAP,GTPase-activating protein）,对于Cdc42功能发挥的时空调控具有重要作用。人们研究发现Bem3能定位到极性生长位点,包括起始出芽位点,小芽顶端以及胞质分裂后期的芽颈处,Bem3还参与了对septin组织的调控,然而,目前并不清楚Bem3如何定位到极性位点以及如何调控septin组织。因此,我们对Bem3进行了结构与功能研究,试图揭示Bem3实现极性位点定位和调控septin组织的机制。首先,我们对Bem3的定位结构域进行了鉴定。通过分析Bem3的结构域,设计一系列Bem3区段与GFP融合表达,在荧光显微镜下观察它们能否定位到极性位点,我们最终鉴定出两个独立的定位结构域—TD1和TD2（TD,targeting domain）,位于N端含有coiled coil结构域的TD2是主要的定位区,位于中部含有PX-PH结构域的TD1是辅助定位区。PX和PH结构域已被人们证明与细胞膜上富含的磷脂酰肌醇具有一定的亲和力,因此,含有PX-PH结构域的TD1能够定位到极性位点是我们所能预料到的,然而,含有coiled coil结构域的TD2却能够更好地定位到极性位点出乎我们的意料之外,我们推测可能存在一些蛋白能与coiled coil结构域相互作用从而招募TD2到极性位点。为了探讨这个可能性,我们以含有TD2的Bem3-N6区段为诱饵进行了酵母双杂交文库筛选,此筛选鉴定出Epol能够与Bem3相互作用,双分子荧光互补实验证实Epol与Bem3在细胞内极性位点处能够相互作用。Epol含有4个coiled coil结构域,它是极性复合体的成员之一,参与调控皮层内质网在芽体顶端的锚定等过程。我们分析发现Epol是通过其第3个和第4个coiled coil与Bem3-N6中的coiled coil相互作用的。当EPO1基因被敲除后,Bem3全长蛋白在极性位点的定位荧光强度显著下降,而TD2的定位完全消失,因此,我们推测Bem3通过与Epo1相互作用,从而被极性复合体招募到极性生长位点。在对TD2的研究过程中,我们还发现Bem3的coiled coil结构域能介导Bem3之间的同源性相互作用,暗示Bem3在细胞内可能以多聚体的形式发挥功能。过量表达Bem3全长会严重抑制细胞生长,细胞失去极性,变大变圆不出芽,推测是由于Cdc42的活性被严重抑制。当我们过量表达不含有coiled coil结构域的区段Bem3△CC时,发现它对细胞生长的抑制能力显著减弱,细胞表现为部分失去极性的表型。Coiled coil结构域的缺失一方面会消除Bem3与极性复合体成员Epo1的相互作用,另一方面会消除Bem3多聚体的形成,由于在epo1A菌株中过量表达全长的Bem3对细胞生长的抑制程度仍然远大于过量表达Bem3△CC对细胞生长的抑制,这表明由coiled coil结构域介导的多聚体形成对于Bem3调控Cdc42的功能具有重要作用。在鉴定出Bem3的TD1和TD2之后,我们接下来测试了它们对于Bem3调控septin组织过程的重要性。通过将一系列内源表达的Bem3区段回补入bem3△ rga1A gi4△菌株中观察此突变体芽体变长缺陷被挽救的情况,我们发现缺失了定位结构域的Bem3△TD1和Bem3△N6相比Bem3全长的挽救能力均有显著的减弱,不含C端RhoGAP结构域的Bem3-N区段几乎没有挽救能力,这表明TD1和TD2参与此过程的功能发挥依赖于RhoGAP结构域。此外,我们还发现在野生型细胞中过量表达Bem3-N区段会使细胞产生芽体变长的缺陷,这些缺陷细胞中的septin组织表现异常,在一些芽体变长细胞的septin组装位点,Bem3-N还与septin共定位,表明Bem3-N与septin组织具有功能性的相互作用,细胞中过量的Bem3-N会干扰septin正常组装,这种效应显然与RhoGAP结构域没有关系。我们还发现这种效应是由含有TD2的Bem3-N6区段而不是TD1介导的,因为过量表达Bem3-N6会造成类似的芽体变长缺陷表型,而过量表达Bem3TD1则没有明显的缺陷产生,表明TD2以某种不依赖于Bem3的GAP活性的方式参与了对septin组织的调控过程。TD2是如何参与调控septin组织的呢?极性复合体的成员之一 Epo1与Bem3存在相互作用,在我们对TD2的研究过程中,有文献报道极性复合体的另一成员Pea2也与Bem3存在相互作用,由于极性复合体的重要功能之一就是调控septin组织形成,因此这一结果启示我们TD2调控septin组织的过程可能与极性复合体功能相关。我们发现在epo1△和pea2△突变体中过量表达Bem3-N6所造成的芽体变长缺陷细胞比例均有显著的降低,这一结果表明过量表达Bem3-N6可能是通过影响极性复合体的功能从而间接影响septin的组装。由于EPO1或PEA2的缺失没有完全消除过量表达Bem3-N6导致的芽体变长缺陷,我们推测TD2可能还与其它参与此过程的某些蛋白存在相互作用。在以Bem3-N6为诱饵进行的酵母双杂交文库筛选中,我们还筛选到了参与信息素应答和菌丝形成过程的丝裂原激活蛋白激酶Kss1。在本研究之前,Kss1一直被认为只定位在细胞核中,然而我们发现Kss1不仅在细胞核中富集,而且还定位在极性生长位点,包括小芽顶端和胞质分裂后期的芽颈处。双分子荧光互补实验证实Bem3与Kss1在细胞内的确能够相互作用,发生相互作用的位点是在septin环的组装位点。由于过量表达Bem3-N6造成的细胞芽体变长缺陷并不受KSS1缺失的影响,Bem3-N6的极性定位也不依赖于Kss1,因此它们之间相互作用的功能意义目前还不清楚。最后,我们发现Bem3能够通过其RhoGAP结构域与激活型的Rho3和Rho1相互作用,这表明Bem3除了作为Cdc42的GAP,还可能是Rho3和Rho1的GAP。通过对BEM3与RHO3和RHO1的遗传学相互作用进行研究,我们认为Bem3可能并不参与Rho1指导的细胞壁合成,而是可能特异性的负调控Rho1参与的actin细胞骨架组织。本论文没有揭示出Bem3与Rho3相互作用所参与的细胞学过程,该问题有待进一步的研究。