论文部分内容阅读
第一部分早发型腓骨肌萎缩症的基因特征研究目的:腓骨肌萎缩症是一组具有高度临床和遗传异质性的周围神经系统遗传病,目前发现80余个基因的近1000余个突变均可导致该病的发生。目前由于基因二代测序技术、全外显子测序、多重连接探针扩增等技术的发展及应用,使得我们对于疾病的认识更为深入。但同时随着检测技术的复杂性日益增加,对于基因检测序列解读的挑战也不断增加。基于临床和遗传学分型,对疾病基因进行突变分析,明确基因诊断的诊断流程在如今的临床工作中显得尤其重要。这有助于临床医生对于疾病的完整认识,并能为后续的预防及治疗提供保障。方法:以2014年4月～2018年3月四年间在浙江大学医学院附属儿童医院临床诊断腓骨肌萎缩症的患儿为研究对象,收集相关临床资料:性别、就诊年龄、起病年龄、起病症状、家族史及神经系统体征;进行肌电图检测及腓骨肌萎缩症相关的基因检测及分析。结果:1.4年间儿童期起病的腓骨肌萎缩症病例共14例,男女比例2.5:1（10:4）,就诊年龄分布从1.8岁至9岁不等,其中13例患儿起病年龄<2岁,6例患儿运动发育里程碑落后;2.依据肌电图结果,诊断腓骨肌萎缩症1型10人,中间型1人,2型3人。10例1型患儿中有6例正中神经复合肌肉动作电位均较正常降低,且正中神经感觉神经传导速度及动作电位均未能引出;3.14例患者的基因检测结果显示11例为已知突变,3例为新突变。突变基因包含PMP22重复突变（6例）、MPZ基因插入突变及点突变（4例）,MFN2基因点突变（3例）及NEFL基因点突变（1例）。其中6例有阳性家族史。3例新发突变分别为 MPZ 基因 c.103104insTGGTTTACACCG（p.D35delinsVVYTD）,MPZ基因 c.394C>G（p.P132A）及 MFN2 基因 c.326A>G（p.K109R）;4.携带 MPZ 基因 c.103<sub>104insTGGTTTACACCG（p.D35delinsVVYTD）杂合突变患儿存在阳性家族史,评级为“可能致病的”。携带MPZ基因c.394C>G（p.P132A）杂合突变患儿为新发突变,评级为“可能致病的”。携带MFN2基因c.326A>G（p.K109R）杂合突变患儿亦为新发突变,评级为“致病的”;5.本文共确诊14例患者的CMT分型,其中6例为PMP22基因重复突变所致的腓骨肌萎缩症1A型;4例为MPZ基因突变所致的腓骨肌萎缩症1B型;3例为MFN2基因突变所致的腓骨肌萎缩症2A型;另1例为NEFL基因突变所致的中间型。结论:本文依据患者的临床表现、神经肌肉电生理特征、遗传模式、二代测序结果,结合临床分型及基因分型,采用美国医学遗传学与基因组学学会指南标准对新发突变致病性进行分析,最终确诊14例腓骨肌萎缩症患者的临床及基因分型。第二部分MPZ基因突变的机制研究目的:MPZ基因c.103104insTGGTTTACACCG（p.D35delinsVVYTD）杂合突变为MPZ新突变,根据美国医学遗传学与基因组学学会指南评判标准,依据人群数据及共分离数据尚不足以确定该新突变的致病性。由此,本文进一步对该MPZ新突变进行功能学研究,以明确其致病性。方法:1.生物信息学分析:利用Swiss-Model进行突变蛋白结构预测。2.质粒构建:合成MPZ野生型和突变型的DNA序列,分别构建MPZ野生型质粒（wtMPZ）和MPZ突变型质粒（insMPZ）,并对质粒进行双酶切验证和测序验证。3.细胞转染:wtMPZ及insMPZ质粒分别转染入细胞。4.2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）处理:在细胞用于免疫荧光及Westernblot实验前,用2mM2-DG处理已转染24h的细胞16h;对于实时荧光定量PCR实验,用2mM2-DG处理已转染24h的细胞24h;在细胞凋亡实验前用2mM2-DG或等体积去血清DMEM预处理12 h。5.实验分组:分为（1）野生型组（wtMPZ组）、（2）野生型+2-DG组（wtMPZ+2-DG 组）、（3）突变型组（insMPZ 组）、（4）突变型 +2-DG 组（insMPZ+2-DG组）。6.实验方法:对各组进行细胞间粘附实验,置于显微镜下观察细胞聚集情况;免疫荧光法检测各组细胞内GRP78、Cleaved Caspase 3表达水平;实时荧光定量PCR 检测各组细胞内 GRP78、CHOP、ATF6、sXBP-1 的 mRNA 表达水平;Western blot方法检测各组细胞内GRP78、CHOP、ATF6、sXBP-1蛋白的表达水平,流式细胞术检测各组细胞内凋亡细胞数。结果:1.生物信息学分析结果:插入突变引起氨基酸序列的改变:p.D35delinsVVYTD。该插入突变编码蛋白序列属于P0蛋白的胞外结构域,突变后,插入的序列增加了一个β折叠结构VY,通过蛋白保守域分析,可知该突变位点位于Ig-like domain内。2.细胞间粘附实验:insMPZ组HEK293细胞间的粘附明显减少。同时,insMPZ组P0蛋白间的聚集较wtMPZ显著增加（p=0.0003）。3.insMPZ突变增加了细胞内GRP78以及sXBP-1的表达:免疫荧光、蛋白电泳及RT-PCR结果均显示insMPZ组GRP78在sNF96.2细胞及HEK293细胞中的表达均较wtMPZ组增加。经2-DG处理后,GRP78水平的上调仅现于wtMPZ组。两组CHOP及ATF6蛋白及mRNA表达水平在HEK293细胞中均无明显差异,经2-DG处理后insMPZ组与wtMPZ组CHOP蛋白及mRNA表达量亦未见改变,insMPZ组ATF6蛋白表达量较前增加,但mRNA表达未见改变。insMPZ组中sXBP-1的蛋白表达量及mRNA水平（p=0.018）均较wtMPZ组增加,同时经2-DG处理后sXBP-1的蛋白表达量及mRNA水平（p=0.013）的增量亦仅见于wtMPZ组。4.insMPZ突变增加施万细胞的凋亡,2-DG诱导凋亡的发生:免疫荧光结果显示insMPZ组增加了 sNF96.2细胞中cleaved caspase 3的表达。2-DG显著增加了insMPZ组cleaved caspase 3的表达。流式细胞术结果显示insMPZ组凋亡细胞较wtMPZ组增加（p=0.006）,予以2-DG处理后两组凋亡细胞均增加,尤其是在ins MPZ+2-DG 组为甚（p=0.001）。结论:1.insMPZ突变编码蛋白序列属于P0蛋白的胞外结构域,插入的序列增加了一个β折叠结构VY,改变了蛋白的二级结构。2.体外实验表明insMPZ突变减少了细胞间的粘附。同时insMPZ突变可启动内质网应激,激活UPR的IRE1途径。insMPZ突变增加施万细胞的凋亡,2-DG诱导凋亡的发生。