精恶唑禾草灵降解菌的分离、降解特性研究及其水解酶基因feh的克隆与表达

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精恶唑禾草灵属于芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,广泛应用于禾本科杂草的防除,目前在我国有较广的应用范围。精恶唑禾草灵在土壤中的残留会对生态环境和后茬作物产生不良影响。以微生物降解为基础的生物修复在消除有机污染方面具有重要作用,一直得到研究人员广泛的关注。本研究从长期使用精恶唑禾草灵的土壤中分离筛选到一株精恶唑禾草灵降解菌,根据其表型特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性分析,将其鉴定为Rhodococcus sp. JPL-2.菌株JPL-2在pH5.0-9.0范围内生长良好,最适生长pH为7.0;最适生长温度为30℃;好氧性生长;最适生长碳氮源分别为果糖和牛肉膏;在NaCl为0-20g·L-1的浓度范围内生长良好;对卡那霉素有抗性。菌株JPL-2能够在以精恶唑禾草灵为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并在60h内对100mg·L-1精恶唑禾草灵的降解率为94.5%;菌株JPL-2对精恶唑禾草灵的最适降解温度为30℃;最适降解pH为7.0;降解速率与接种量成正相关;精恶唑禾草灵的初始浓度越高,所需的降解时间越长。运用鸟枪法构建菌株JPL-2基因组DNA文库,克隆到一个精恶唑禾草灵水解酶基因,命名为feh。该基因大小为1140个碱基,编码380个氨基酸。通过在线比对同源性,该基因与Rhodococcus sp. T1中羧酸酯酶基因(GenBank accession No.JF970231)的序列相似性为77%。以pET29a为表达载体,构建表达质粒pET29a-feh,实现了FEH蛋白在E.coliBL21(DE3)中的融合表达,并通过镍离子亲和层析的方法纯化得到了融合蛋白FEH。对FEH进行酶学特性研究,结果表明:FEH在10℃-40℃之间均具有较高的稳定性,在pH7.5,35℃时活性最高;在1mmol·L-1的浓度条件下,FEH除对Ni2+, Hg2+, Ag+三种离子敏感外,其它金属离子如Fe2+, Cu2+, Mg2+, Al3+等对其活性没有明显影响。
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