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卵巢癌的死亡率位居妇科肿瘤首位,严重威胁女性健康。目前卵巢癌的一线化疗方案仍以铂类药物为主。尽管初始治疗时,80%卵巢癌患者对一线化疗药物敏感,但随着化疗次数递增,多数中晚期卵巢癌病人癌灶复发并逐渐产生耐药,其机制至今仍未完全阐明。本课题共分为三个部分:(1)上皮性卵巢癌铂类耐药基因的筛选及验证;(2)探讨PAX9在上皮性卵巢癌铂类耐药中的双向作用机制;(3)PAX9与上皮性卵巢癌患者耐药结局及预后的临床研究。研究目的:1、筛选出参与上皮性卵巢癌铂类耐药行为的候选耐药基因;2、探讨PAX9在上皮性卵巢癌铂类耐药中的作用机制;3、探讨PAX9蛋白与上皮性卵巢癌患者病理特征、耐药结局及预后的临床关系。研究方法:1、通过基因芯片对A2780卵巢癌细胞株及获得性顺铂耐药细胞株A2780DR进行差异基因的筛选,确定候选耐药基因,并通过Real-time PCR验证上述结果;2、MTS法检测下调各候选基因后,耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性变化,进一步筛选耐药基因;3、Western blot检测耐药候选基因在各卵巢癌细胞株中的蛋白表达情况,;4、Real-time PCR及Western blot检测A2780DR-PAX9 shRNA细胞中经典多药耐药基因及蛋白变化;5、稳定上调A2780、ES2、HO8910、SKOV3细胞中PAX9表达,Real-time PCR及Western blot检测各细胞中经典多药耐药基因及蛋白变化;6、mRNA芯片检测PAX9调控的下游转录因子情况;7、ChIP-seq检测PAX9与下游基因启动子区域的结合情况;8、MTS法观察上调及下调PAX9表达后,卵巢癌细胞对顺铂敏感性的变化;9、下调A2780DR细胞中p53表达,MTS法测定细胞IC50变化;10、流式细胞术检测PAX9对A2780DR细胞的细胞周期影响;11、流式细胞术及Western blot检测A2780DR-PAX9 siRNA细胞加入顺铂后,细胞凋亡比例及相关凋亡蛋白caspase-3、PARP的变化;12、Western blot检测卵巢癌细胞株中p53及p21蛋白的表达情况;13、选择上皮性卵巢癌铂类敏感及耐药患者各40例,免疫组化染色法检测肿瘤组织中PAX9表达情况,并与患者耐药结局、病理特征及预后进行相关性分析;14、选择72例上皮性卵巢癌患者,ELISA检测癌组织及术前血浆标本中的PAX9蛋白表达情况,并与患者耐药结局、病理特征及预后进行相关性分析。研究结果:1、通过基因芯片的筛选分析,确定IFI16、ZNF253、PAX9及ARNTL2等15个基因为候选耐药基因;2、下调PAX9及ARNTL2后,增加A2780DR细胞对顺铂治疗的敏感性;3、PAX9蛋白在卵巢癌耐药细胞株A2780DR中表达明显,而在A2780、ES2、HO8910及SKOV3细胞株中表达较低;4、干扰PAX9后,p53、Bax、Bcl-2、ABCB1、ABCC2等耐药相关基因表达下调;5、稳定上调PAX9后,p53、Bax、ABCB1等耐药相关基因表达增加;6、ChIP-seq提示PAX9在p53基因启动子区域存在结合位点;7、上调PAX9后,A2780、HO8910细胞IC50上升,而SKOV3、ES2细胞IC50下降;8、下调A2780DR细胞中PAX9或p53表达后,IC50均明显下降;9、下调PAX9表达后,A2780DR细胞处于G1期的比例下降,顺铂作用后凋亡细胞比例及凋亡相关蛋白表达均明显增加;10、p53蛋白在SKOV3细胞中未见明显表达,而p21蛋白在ES2及SKOV3细胞中均未见明显表达;11、免疫组化染色及ELISA结果提示铂类耐药患者肿瘤组织中PAX9表达明显高于铂类敏感患者(P<0.05),且临床分期越高,PAX9阳性率及表达程度越高;12、肿瘤组织中PAX9蛋白浓度较高(≥145 ng/g)患者无进展生存期较短(P<0.05)。结论:1、PAX9在卵巢癌耐药细胞株及耐药患者肿瘤组织中高表达,下调后增加耐药细胞对顺铂的敏感性;2、PAX9可能调控Bax、p53、ABCB1等耐药相关基因,并在p53基因启动子区域存在结合位点;3、PAX9发挥双向耐药调控作用:当肿瘤细胞表达有功能的p53时,PAX9可能通过上调p53使细胞停滞于G1期,促进耐药,当肿瘤细胞未表达有功能的p53时,PAX9可能通过上调Bax促进细胞凋亡,促进药敏;4、PAX9表达水平与上皮性卵巢癌患者的疾病进展、耐药结局及生存期密切相关。