新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是由围生期窒息导致的新生儿脑损伤疾病,是引起患儿脑瘫、智力运动发育落后和新生儿死亡的主要原因。目前研究已发现多种与HIE病理相关的机制,包括脑血流量减少、脑组织中能量代谢变化、炎性调节因子和氧自由基的破坏、异常氨基酸对神经元的毒性作用、钙内流和脑细胞凋亡等。目前,临床上新生儿HIE的早期诊断主要通过病史、临床症状和体征、计算机断层扫描(computer tomography,CT)、磁共振成像技术(magnetic resonance imaging,MRI)、超声和常规脑电图(conventional elecroencephalogram,c EEG)等。然而,这些检测手段各有不同的局限性和有效性。生物标志物是特定的组织和器官的产物。新生儿HIE发病后,受损的脑组织释放特定的组织成分或产物进入血液或脑脊液,因此,新生儿HIE血液或脑脊液生物标志物的表达可表征脑损伤,反映损伤程度,以便于早期实施干预措施,以降低新生儿死亡率和残疾程度,提高新生儿存活质量。目前已从血清、脑脊液和尿液中分离出S100β蛋白、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膜收缩蛋白降解产物(spectrin breakdown products,SBDPs)、泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)、Tau蛋白、人磷酸化神经丝H(phosphorylated neurofilament heavy chain,p NF-H)等分子标记物,有助于确定脑损伤发生的时间和预测远期预后。目前对S100β、NSE、GFAP、BDNF研究较多。对UCHL1、SBDPs、Tau和脑损伤的关系研究多集中在创伤性脑损伤方面,且相比S-100β蛋白、NSE、GFAP等在临床应用研究较少,我们希望把这些指标应用到新生儿HIE脑损伤中,以探讨其作用及机制。UCHL1是一种半胱氨酸蛋白酶,是存在于神经元和神经组织中的胞质酶。最近UCHL1被认为是神经元损伤生物标志物。已有研究发现,脑脊液和血液中UCHL1的高表达与神经元损伤和血脑屏障的破坏有关。据最新研究报道,在多种神经性疾病中UCHL1浓度较高,如动脉瘤性蛛网膜下腔出血、创伤性脑损伤、中风等。然而,UCHL1水平上升的原因与HIE引起的神经元凋亡相关的机制还不清楚。SBDPs是αII膜收缩蛋白裂解产物,而αII膜收缩蛋白大量存在于神经元的轴突和突触前末梢,是皮层细胞骨架的主要成分。αII膜收缩蛋白经钙蛋白酶(calpain)分解可得到SBDP150和SBDP145,而经半胱天冬酶-3(caspase-3)分解可得到SBDP120。由于calpain和caspase-3是脑缺血和脑损伤发生时促进细胞坏死和细胞凋亡的重要因子,因此SBDPs可能与脑损伤造成的脑细胞损害存在着联系,可以成为一种脑损伤的标志物。Tau蛋白是细胞骨架结构与轴突运输所必需的微管相关蛋白,主要分布于轴突和周围神经系统。健康成人或新生儿血液或脑脊液中Tau蛋白含量极少,在神经损伤、创伤性脑损伤或中枢神经系统的某些疾病中,Tau蛋白可从神经轴突或胞体释放,引起血清或脑脊液中Tau蛋白升高,揭示血清或脑脊液中Tau蛋白水平可作为预测脑损伤的指标。有研究发现,未成熟大脑缺氧缺血后Tau蛋白的胞外水平显著升高。因此,本课题首先应用ELISA实验检测了新生HIE患儿外周血清中UCHL1浓度,并通过小干扰RNA技术抑制人神经元细胞系AGE1.HN中UCHL1的表达,以探索抑制UCHL1的表达对细胞凋亡的影响,同时研究了低氧环境下UCHL1对神经元细胞的功能作用及相关分子机制。为进一步探究SBDPs和Tau蛋白作为新生儿HIE的血清标志物的可能性,我们用ELISA实验检测了不同程度HIE患儿外周血中SBDPs和Tau蛋白浓度,并对SBDPs和Tau用于诊断HIE进行了ROC曲线分析。最后,对新生HIE患儿予以振幅整合脑电图(amplitude integrated electroencephalography,a EEG)检测,探讨a EEG在新生HIE中的早期诊断及预后评估的价值。本研究旨在寻找早期监测新生儿血清中HIE相关的生物标志物和检测手段,为新生儿HIE的预测和临床干预治疗提供新的理论依据。第一部分HIF1α和HIF2α调控的UCHL1在缺氧诱导的神经元细胞损伤中的作用研究目的:探索UCHL1在缺氧诱导的神经元细胞损伤中的作用及与缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIF)的调控关系。方法:1.收集出生24小时内的新生儿缺氧缺血性脑病患儿和同期产科出生的足月健康新生儿(各20例)的血清,采用ELISA实验检测血清中UCHL1的水平。2.AGE1.HN细胞培养于DMEM培养基与Ham’s F-12培养基按1:1混合的培养基中,其中含有5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 units/ml青霉素、100 ng/ml链霉素、10 mg/m L人转铁蛋白和30 mmol/L亚硒酸钠。正常情况下细胞培养于37°C常氧环境(20%O2)的培养箱中。当细胞缺氧处理培养时,细胞培养于37°C缺氧环境(1%O2)的培养条件下。3.由广州瑞博生物公司根据UCHL1的序列合成3条靶向UCHL1的si RNA,分别为si UCHL1-1、si UCHL1-2和si UCHL1-3,以及根据HIF1α和HIF2α的序列合成靶向HIF1α和HIF2α的si RNA各一条,分别为si HIF1α和si HIF2α。4.利用lipofectamine 2000将各种si RNAs或对照转染至AGE1.HN细胞中。5.利用流式细胞仪技术检测经1 ng/ml、5 ng/ml和10 ng/ml的UCHL1处理48 h后的AGE1.HN细胞凋亡情况。6.CCK8实验检测了转染有si UCHL1-1、si UCHL1-2和si UCHL1-3的AGE1.HN细胞增殖活力。7.荧光定量PCR检测低氧培养条件下AGE1.HN细胞中UCHL1的m RNA水平变化。8.Western blot检测经HIF1α或HIF2α表达抑制预处理后再低氧培养的AGE1.HN细胞中UCHL1的蛋白水平变化。9.染色质免疫沉淀分析检测HIF1α和HIF2α是否通过结合UCHL1启动子上的低氧反应元件位点促进UCHL1转录。结果:1.HIE患儿血清中UCHL1平均浓度为3.3 ng/ml,而健康新生儿血清中UCHL1平均浓度为2.0 ng/ml。HIE患儿血清中UCHL1的浓度与健康新生儿血清中UCHL1浓度相比,差异有统计学意义(P<0.05)。2.UCHL1处理AGE1.HN细胞组与未处理组相比,凋亡细胞数显著增加(P<0.05),且UCHL1处理浓度越高,凋亡细胞数越多,10 ng/ml UCHL1处理细胞后,凋亡细胞数是未处理组的5倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.与转染si Control的细胞活力相比,转染有si UCHL1-1、si UCHL1-2和si UCHL1-3的AGE1.HN细胞活力显著增加。4.AGE1.HN细胞在低氧(1%)条件下培养12 h、24 h或48 h后,荧光定量PCR和Western blot检测发现,随着细胞在低氧条件下培养时间的延长,UCHL1的m RNA和蛋白水平逐渐显著性增加,且培养48 h后,UCHL1的m RNA水平增加了1.9倍。5.AGE1.HN细胞经HIF1α或HIF2α表达抑制预处理后再低氧培养,表达UCHL1的能力显著低于仅经低氧培养处理的AGE1.HN细胞。6.AGE1.HN细胞低氧处理前抑制HIFα的表达或转染si UCHL1-1、si UCHL1-2或si UCHL1-3,细胞凋亡数与仅低氧处理的细胞凋亡数显著降低。7.染色质免疫沉淀分析发现,当AGE1.HN细胞培养于低氧条件时,HIF1α或HIF2α可与UCHL1启动子结合,而正常氧培养条件下HIF1α和HIF2α不能与UCHL1启动子结合。荧光定量PCR结果显示,HIF1α或HIF2α显著富集在UCHL1启动子上低氧反应元件位点附近,而在远端无低氧反应元件位点处含量较少。结论:UCHL1参与缺氧缺血性脑损伤的细胞凋亡机制,UCHL1启动子的低氧反应元件位点结合HIF促进UCHL1转录。第二部分SBDPs和Tau蛋白在新生儿缺氧缺血性脑病中的表达研究目的:探讨SBDPs和Tau蛋白在不同程度和不同治疗方案的HIE患儿中的表达,明确其对HIE的诊断和预后预测的价值。方法:1.选择132例HIE患儿,分为30例轻度组、52例中度组,50例重度组。同一时期因新生儿肺炎入院的30例新生儿为对照组。2.对照组、轻度组、中度组、重度组的各30例患儿常规治疗。收集新生儿治疗前,治疗后1天、3天、5天和7天的血清样本。ELISA实验检测SBDPs和Tau蛋白的表达水平。3.中度组的22例和重度组的20例患儿经亚低温治疗。收集新生儿治疗前,治疗后1天、3天、5天和7天的血清样本。ELISA实验检测SBDPs和Tau蛋白的表达水平。4.记录患儿28天、3个月、6个月和12个月的临床参数。对患儿综合身体体检(体重、身高和头围等)及神经发展情况进行跟踪评估。在出生后28天,进行NBNA评分,其总分为40。总分低于35分表示脑损伤,35~37分表示疑似脑损伤,37分及以上表示正常发育。在出生后3个月、6个月和12个月用Gesell发育评价进行DQ测试。试验包括动作能、应物能、言语能、应人能。测试的结果以总体的DQ值表示,55~75分表示轻度智力障碍,40~54分表示中度智力障碍,低于40分表示重度智力障碍。结果:1.在相同的治疗时间点,SBDPs和Tau蛋白的血清水平随着HIE严重程度的增加而显著增加(P<0.05)。采用亚低温治疗的中度组和重度组中的患儿的SBDPs和Tau蛋白血清水平则显著低于相对应时间点的常规治疗的中度组和重度组中的患儿的SBDPs和Tau蛋白血清水平。2.在随访期间,NBNA分值随着HIE严重程度的增加而降低。采用亚低温治疗的中度组和重度组患儿的NBNA分值显著高于常规治疗的中度组和重度组患儿的NBNA分值(P<0.05)。3.第3个月、第6个月和第12个月的随访数据显示,在每个相对应的时间点,DQ随着HIE严重程度的增加而降低,采用亚低温治疗的中度组和重度组中患儿的DQ值则显著高于相对应时间点的常规治疗的中度组和重度组中的患儿的DQ值(P<0.05)。4.ROC曲线分析检测发现,SBDPs水平诊断HIE的ROC曲线的曲线下面积值为0.934(P=0.0001)。当临界点值为1.57 ng/ml时,诊断的敏感性和特异性分别达到84.1%和87.2%。根据Tau水平诊断HIE的ROC曲线的曲线下面积值为0.938(P=0.0001)。当临界点值为4.72 pg/ml时,诊断的敏感性和特异性分别达到79.1%和96.3%。结论:1、SBDPs和Tau蛋白参与HIE的脑损伤过程,随着HIE严重程度的增加,这两种蛋白表达量增加。2、亚低温治疗使SBDPs和Tau蛋白表达量降低,相同分度HIE患儿中SBDPs和Tau蛋白表达量低的患儿远期随访预后相对较好。第三部分振幅整合脑电图在新生儿缺氧缺血性脑病患儿中的应用目的:探讨振幅整合脑电图(a EEG)在新生儿缺氧缺血性脑病中的早期诊断及预后评估的价值。方法:1.对第二部分中的132例HIE患儿和30例对照组患儿入院时和出院前进行振幅整合脑电图检查。用Olympic CFM 6000脑功能监护仪对受试者实施监测。全部a EEG所得图像均由专业人员分析。2.观察指标:(1)连续性,依照a EEG背景活动对连续性进行评估,分成a:连续性脑电图,即连续性活动,a EEG下边界(最低电压)大约为(5)7~10 u V,上边界(最高电压)大约为10~25(~50u V),在足月儿这种类型常被称为连续正常电压。b:不连续性脑电图,a EEG下边界可变,但最小波幅的变动主要小于5 u V,但最大波幅大于10 u V。(2)睡眠-觉醒周期(Sleep wake cycling,SWC),特征为平滑的周期性变化,主要指下边界,振幅规律性正弦波,且周期持续时间>20 min。其中宽带代表睡眠期,而窄带代表觉醒期。(3)最低电压,即最低水平的脑电活动振幅。(4)最高电压,即最高水平的脑电活动振幅。(5)a EEG异常程度判断:其中连续正常电压为正常a EEG波形,不连续电压或连续正常电压合并单次惊厥活动为轻度异常,其余背景活动类别或反复惊厥或癫痫持续状态均为重度异常a EEG。结果:1.HIE组振幅整合脑电图呈现为连续性的比例为34.09%(45/132),SWC为成熟SWC的比例为27.27%(36/132),均显著低于对照组的100%(30/30)及100%(30/30)。差异有统计学意义(P<0.05)。提示HIE患儿的振幅整合脑电图以不连续性为主,SWC则主要是不成熟的SWC。2.HIE组的最高电压振幅为56.52±19.29 u V,明显高于对照组的37.61±2.53 u V;最低电压振幅为4.28±1.38 u V,明显低于对照组的7.61±0.86 u V。差异有统计学意义(P<0.05)。提示HIE患儿的最高电压升高,但最低电压又降低。3.132例HIE患儿中,临床分期有30例轻度HIE患儿,52例中度HIE患儿,50例重度HIE患儿。而a EEG所得结果中,a EEG正常者含36例,轻度异常者含50例,重度异常者含46例。30例对照组a EEG分类显示为正常。依据Spearman法行相关性分析后发现,a EEG的监测结果和HIE临床分级呈正相关(r=0.869,P<0.05)。4.132例HIE患儿出院前检查结果中,a EEG正常者含74例,轻度异常者含40例,重度异常者含18例。随访12个月时,132例患儿中,DQ值小于55分的有11例,占比8.33%。结论:a EEG能够反应出新生儿HIE病变程度以及远期预后,且操作简便,诊断有效,可连续监测,值得临床普遍推广使用。