研究背景与目的目前世界范围内癫痫的患病率约为0.5%-1.5%,全球约有5000万人罹患癫痫。长期反复的癫痫发作严重威胁患者的健康和生活,并对患者的家庭及社会造成极大的影响和负担。常染色体显性夜发额叶癫痫(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE)是基因遗传的特发性部分性癫痫。其特征表现为发生于非快动眼睡眠期的额叶起源成簇短暂性运动性发作。ADNFLE可由编码烟碱乙酰胆碱受体(neuronal nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)α4、β2、和α2亚基的基因(CHRNA4、CHRNB2、CHRNA2)突变引起。nAChR属于半胱氨酸环受体家族成员,在人脑内最常见的nAChR由α4和β2亚基构成。目前为止,在ADNFLE家系中发现的突变均位于亚基的第一、第二或第三跨膜区。但在中国的ADNFLE家系中尚未发现以上基因的突变。散发性NFLE在临床表现和对药物的反应上与ADNFLE非常相似,故推测二者可能有类似的遗传学基础。事实上,散发性NFLE患者中已发现了CHRNA4的突变。目前CHRNB2和CHRNA2的突变在散发性NFLE患者中尚未发现。本研究的目的是在中国散发性NFLE患者中筛查CHRNA4、CHRNB2和CHRNA2突变,并对突变引起的nAChR亚基蛋白质结构功能变化做初步探讨。研究方法经临床资料、家族史及辅助检查VEEG和头MRI等综合诊断,募集105名中国NFLE患者并同时募集200名健康对照受试者,采外周血提取基因组DNA。依据已知的基因序列设计引物,聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增编码受体亚基第一、第二和第三跨膜区的片段,分别为CHRNA4的第五外显子, CHRNB2的第五外显子和CHRNA2的第六外显子。送纯化的PCR产物进行测序。测序得到的变异经反向测序确认,并在对照组中用同样的方法筛查,确定其为基因突变。最后应用生物信息学软件分析对比突变蛋白和野生型蛋白的疏水性及蛋白质二级结构,推测可能出现的功能改变。结果我们在一名19岁女性患者中发现了CHRNB2的V337G突变。突变位于第三和第四跨膜区之间的胞内环部分。不同物种的多重序列对比显示突变位于蛋白质的进化保守区。与野生型蛋白相比,突变蛋白质的疏水性下降。二级结构预测显示突变明显改变了其周围结构。另在一名7岁的男性患儿中发现CHRNA4的S405F突变。本突变同样位于第三和第四跨膜区之间的胞内环部分,同样位于蛋白质的进化保守区。通过生物信息学软件分析,突变位点临近区域的疏水性较野生型蛋白有所上升,并部分改变了临近区域的蛋白质二级结构。患儿父亲携带同样突变但不发病。在CHRNA2的筛查范围中,未发现任何突变。结论中国人群中发现的CHRNB2-V337G突变和CHRNA4-S405F突变可能为散发性NFLE患者的新型遗传学病因。nAChR亚基的第三和第四跨膜区胞内环区域突变可能与NFLE的发病相关。在散发性NFLE患者中首次发现CHRNB2突变进一步证实了散发性和遗传性NFLE有相似的遗传学背景。携带S405F突变的家系外显不全的现象说明在NFLE发病中尚有其他遗传和环境因素的参与。CHRNA2突变没有在研究中被发现,推测此类突变在散发性NFLE中可能相当稀少。研究背景与目的在神经系统疾病中,癫痫是仅次于脑血管疾病的第二大病种。最新的流行病学资料显示我国约有900万癫痫患者,且年增加新诊断患者30-40万人。癫痫严重影响了患者的健康和生活质量,并给患者家庭和社会带来极大的疾病负担。额叶癫痫(frontal lobe epilepsy, FLE)是临床上发病率第二高的部分性癫痫,多于儿童及青少年期起病,有发作频繁形式多样的临床特点,对患儿的身心成长造成严重影响。FLE的遗传模式可以表现为孟德尔式的常染色体显性遗传或表现为不遵循孟德尔定律的复杂疾病模式。常染色体显性遗传夜发额叶癫痫(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE)外显率约为70%-80%。1995年,在一个澳大利亚ADNFLE家系中发现了烟碱乙酰胆碱受体(neuronal nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)α4亚基基因(cholinergic receptor, nicotinic, alpha 4, CHRNA4)的突变。这是在特发性癫痫中定位的第一个致病基因。之后陆续发现了其他两个ADNFLE的致病基因,胆碱烟碱受体β2亚基基因(cholinergic receptor, nicotinic, beta 2, CHRNB2)和胆碱烟碱受体α2亚基基因(cholinergic receptor, nicotinic, alpha 2, CHRNA2)。目前在这三个基因中发现的致病突变均位于编码蛋白质的第1、2、3跨膜区(transmembrane domain, TM)。临床上,非家族性的FLE患者数量远远多于家族性患者,并且二者的临床特征没有明显差别。散发性FLE是由遗传因素和环境因素共同作用所引起的复杂疾病,其中遗传因素在FLE的起病和发展过程中起到重要作用。世界范围内,研究者已在3名散发性FLE患者中发现了CHRNA4和CHRNB2的突变,说明二者有相似的遗传学病因,即nAChR亚基基因的突变与散发性FLE的发病也有密切关系。随着人类基因组计划(Human Genome Proj ect, HGP)的不断深入,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)与疾病的关系越来越受到重视并被广泛研究。虽然关于FLE的突变筛查已取得了很多成果,但nAChR亚基基因SNP位点与散发性FLE的关系还没有做过相关研究。在家族性及散发性FLE患者中发现的所有致病突变中,CHRNA4基因的突变占50%以上,并且体内外实验证实nAChR的α4亚基对通道功能和受体敏感性有重要影响。因此我们推测CHRNA4基因可能是FLE的易感基因,故本研究的目地是探讨CHRNA4编码区的基因多态性与FLE的关联。研究方法本研究中,我们在182名中国散发性FLE患者及健康对照组中采用病例对照关联研究设计,探讨CHRNA4基因的蛋白质编码区SNP位点多态性是否与FLE的发病有关,分析CHRNA4的SNP位点基因型和FLE患者临床变量的相关性,多SNP位点间是否对FLE发病起到协同作用。从SNP数据库和以往文献中选择CHRNA4编码区的6个SNP位点,在中国汉族健康人群中初步检测,选择适合关联分析的位点进入实验。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)和直接测序的方法进行基因分型。应用统计软件计算CHRNA4蛋白质编码区SNP基因型及等位基因频率和FLE的关联以及与临床表型的关系。应用统计软件进行单体型分析。采用随机抽取10%的样本复测作为质量控制手段。结果经过在中国汉族健康人群中的初步检测,最终共选择4个适合分析的位点,rs2229959、rs1044393、rs1044396和rs1044397进入研究。经统计分析,CHRNA4基因编码区SNP位点等位基因与基因型均FLE发病无明显统计学差异,所有P值均>0.05。结论根据我们在中国散发性FLE患者和健康对照组中做的病例对照研究结果,CHRNA4编码区的基因多态性可能与中国人群散发性FLE发病无关。