第一部分Y染色体新STR基因座的筛选 1.前言Y染色体是男性特异染色体，除去其两端约3Mb的区域可以和X染色体进行重组外，其它区域不会在减数分裂时和同源染色体发生重组，叫非重组区(NRY,non-recombiningregionoftheYchromosome。又称男性特异区(MSY，manspecificregionoftheYchromosome)。曾经认为Y染色体除了决定性别外没有其它作用，现在的研究发现Y染色体上有许多重要功能基因。由于不会发生重组，除非发生突变，一个男性的所有后代均含有同样的Y-染色体遗传标记构建的单倍型。这些性质使Y染色体成为研究许多领域的重要工具。Y染色体的遗传标记有小卫星序列(MSY)，微卫星序列Microsatellite，MS)，单核苷酸多态性(SNP)，等。其中的微卫星序列，或称为短串连重复(STR)，是以2-6bp为核心序列的串连重复。它们的多态性高，片段短，分型容易，还具有男性伴性单倍型遗传的特点，在法医学、进化学、群体遗传学和医学遗传学等领域都有重要价值。 在法医学方面，用Y-STR分析可以进行性犯罪案件中收集到的混合斑的个人识别。用常染色体STR分析可以进行混合斑的个人识别，但是要分离精子和女性的成分，不总是成功。如果男性是输精管结扎或者无精症患者，就完全不能用这种方法。在一些检材，如含多个男性精子，各种体液形成的混合斑(来源于不同性别)等，的鉴定中，Y-STR是很有用的工具。亲权鉴定时，如果超过两代，用常染色体来进行亲权鉴定很困难。在这两种情况下，Y-STR是一种很有用的工具。 Y-STR的研究主要集中在几个方面。首先是发现更多的Y-STR基因座，并阐明其基因座特点。由于没有交换，是单倍型遗传，所以需要用更多的Y-STR基因座才能得到足够的信息，比如法医学上对个人识别能力和父权排除率的要求。有了更多的Y-STR，排除男系亲属的能力会增加。第二，突变率和突变机制的研究。用突变率可以对人类进化时间进行定量研究。在法医学上，有了对突变率和突变机制的深刻了解，可以更准确的解释结果，下更精确的结论。第三，研究其在不同群体内的基因频率和单倍型频率。这是其在各方面，特别是法医学方面的应用基础，由于Y染色体容易受到选择性清除和遗传漂变的影响，其基因频率和单倍型频率更容易在不同群体间产生差异。因而寻找更多的多态性高的Y-STR基因座具有重要意义。 为了查找新的Y-STR基因座，用已经完成的Y染色体DNA序列为对象，寻找STR基因座，并对其基因座特点进行研究，同时调查了等位基因频率和单倍型频率在汉族人群体中的分布。 2.新Y-STR的查找。在Y染色体的X染色体退化序列(X-degenerate)序列中，选择AC006989(157666bp)和AC011289(80537bp)作为查找新STR基因座的区域。用Tandemrepeatsfinder软件，查找重复单位为3-6bp，完整连续重复8次以上的微卫星。共查到8个符合要求的基因座(AC006989三个，AC0112895个)。在这8个基因座两端约200bp范围内设计引物，用降温(Touchdown)PCR方法进行PCR扩增，产物经银染后判断扩增片段长度，确定是否有多态性。用e-PCR和BLAST等方法在GenBank、Genomedatabase和STRbase查找，确定基因座没有被报道过。根据这两个克隆在Y染色体上的位置，将这8个基因座定位于Yq11.221。把有关数据提交到Genomedatabase后，得到基因座名字。 3.新Y-STR的结构特点及和黑猩猩同源序列对比、等位基因的命名。根据国际法医遗传学会推荐的命名原则来命名等位基因。为了使采用其它引物扩增同一基因座时不改变等位基因的名字，把和黑猩猩同源序列相比没有变化的重复模块排除在外。 4.8个新Y-STR的等位基因和单倍型频率在汉族人群体中的分布108个在汉族样本中，DYS719发现了4个等位基因，基因多样性为0.4954；DYS709有5个等位基因，基因多样性为0.7039；DYS720发现了11个等位基因，基因多样性0.8681，它由两个高度可变的重复模块组成，使之有最高的基因多样性。DYS718基因座有5个等位基因，基因多样性为0.5554；DYS708基因座由5个等位基因，基因多样性为0.7056；DYS721基因座有4个等位基因，基因多样性为0.4563；DYS722基因座有5个等位基因，基因多样性为0.6217；DYS723基因座有5个等位基因，基因多样性为0.6271。基因多样性和平均重复次数的相关分析显示在这两者之间存在正相关(R=0.820，adjustedR2=0.620，F=12.432，P＜0.02)，提示不只是在一个基因座内，在基因座之间也存在着重复次数越多，越容易产生突变，从而产生较高的基因多样性这种倾向。 用这8个基因座进行分析，在108个汉族个体内发现104种单倍型。其中100个单倍型为单一个体，另外4种单倍型分别有两个个体。单倍型多样性为0.9989±0.0002，即这8个基因座在法医学上的亲权否定概率和个人识别能力均为99.89％。主成分分析显示各基因座之间相关性很小(最高相关系数在DYS719和DYS720之间，相关系数-0.305，P＜0.001)，得到＞85％的信息需要6个主成分。 第二部分亲权鉴定结果判断标准的研究 1前言STR的应用极大地提高了亲权鉴定能力，甚至可以在单亲(父亲或者母亲)和孩子之间进行亲权鉴定。对一个基因座在法医学上应用价值时，其中一个重要参数是非父排除概率(PE，powerofexclusion)，它是基于双亲均在的亲权鉴定(简称双亲案亲权鉴定)计算的，不适合于单亲案亲权鉴定(既缺父或母的亲权鉴定)。研究表明STR基因座的的突变率较高。在出现矛盾基因座时，如何对结果进行判定，在国际法医学界还没有同一的认识(包括单亲和双亲亲权鉴定)。运用概率学理论，我们计算了单亲否定概率，结合有关数据和我室多年的实践经验，参考国外相关做法，对亲权鉴定时出现矛盾基因座时检验以及下结论的策略等问题作一探讨。 2单亲案亲权否定概率PE1和单亲鉴定时结果判定策略计算单亲案亲权否定概率时把孩子为纯合子和杂合子分别考虑。设Ai为一个基因座的等位基因，Pi为相应的基因频率，则在孩子为杂合子AiAj(概率为2PiPj)时，待排男子不含Ai也不含Aj时(机会为(1-Pi-Pj)2)被排除。同样的道理，孩子为纯合子AiAi(P2i)时，待排男子不含Ai(机会为(1-Pi)2)时被排除。各基因座的PE1均低于双亲案亲权否定概率(平均0.575)。当单亲案亲权鉴定出现0、1、2个矛盾基因座时，分别应该检测15、25、36个基因座才能下肯定的结论。如果出现两个矛盾基因座，而检测基因座数量低于17个时，似然率小于0.042，倾向排除亲权关系。 3双亲案亲权鉴定所需基因座的数目及出现矛盾基因座时结果判定策略根据平均非父排除率和突变率，用二项分布公式分别计算双亲案亲权鉴定在检测9，13，15，17和24个基因座时，真父和随机男出现0，1，2，3，4个矛盾基因座的概率和似然率。结果显示如果没有矛盾基因座出现，检测9个基因座时似然率为2000，但是非父出现这种情况的概率在也有0.0005；出现1个矛盾基因座，检测17个STR基因座时，似然率为2.3×103。检测24个STR基因座，真父和随机男人出现2个，3个和4个矛盾基因座的似然比分别为1087，1.408和0.002。如果以似然率为1000(相当于父权概率为99.90％)作为判定标准，建议亲权鉴定中应该检测13个以上的STR基因座。出现1个和2个矛盾基因座时，应该分别增加检测到17和24个基因座，没有新增矛盾基因座，才能下肯定的结论。检测到3个矛盾基因座时，应该用其它方法作进一步的分析。出现4个矛盾基因座时，可排除父权关系。 4.讨论和传统的基于蛋白和多糖的遗传标记相比，DNA遗传标记在亲权关系鉴定中的应用，极大地提高了亲权鉴定能力，但是STR的突变率较高(0.02％到0.34％之间，平均0.17％)，在亲权鉴定时，常会遇见矛盾基因座，因此出现少量矛盾基因座时，应该如何下结论在国际法医学界还没有同一的认识。由于在单亲鉴定时失去了双亲一方的信息，因此应该有不同的判定标准和策略。根据不同情况下的似然率，我们建议在单亲案亲权鉴定时应该检验15个以上的基因座，以3个矛盾基因座为排除结论的界限。如果出现一个矛盾基因座，应该检测25个基因座，而出现2个矛盾基因座时应该检测36个以上的基因座。而双亲案亲权鉴定，应该检测13个以上的基因座，以4个矛盾基因座为得出排除亲权关系结论的界限。出现一个矛盾基因座时，应该检测17个以上的基因座，出现2个矛盾基因座时，应该检测24个以上的基因座。出现3个矛盾基因座时，应该加做基因座或者用其它遗传标记进一步检验。我们实验室近几年进行的近6000多例亲权鉴定案例中，均按照这个结果判定策略来下结论，均未发现争议，实践证明这一标准是可靠的。