糖尿病是一种复杂的糖脂代谢紊乱性疾病,发病率日趋增高,进行性β细胞缺失及损伤是糖尿病发生发展的中心环节。目前的抗糖尿病药物并没有针对胰岛β细胞再生的药物,只能延缓疾病进展,不能从根本上治愈该病。通过胰腺移植虽然可以达到治疗糖尿病的目的,但除了供体缺乏的问题,移植后免疫排斥问题亦限制了其广泛应用。随着组织工程技术的发展,胰岛及胰岛β细胞的移植为糖尿病的治疗提供新策略。在胰岛细胞移植过程中,移植部位和移植载体的选择是移植成功的关键。临床上90%胰岛移植通过门静脉在肝脏进行,然而很多胰岛细胞在移植过程中丢失,移植后不能长期发挥作用。研究显示骨骼肌能够满足胰岛细胞对微环境的要求,且方便胰岛素分泌细胞移植后的监测。提示肌肉组织作为葡萄糖摄取的关键靶器官可能成为潜在的胰岛细胞移植部位。然而成团胰岛素分泌细胞的移植会导致细胞团局部缺氧,影响细胞存活能力。因此制备能为细胞生长提供新陈代谢环境和增殖空间的可降解细胞支架成为胰岛细胞移植的关键。细胞支架作为细胞移植载体具有极其重要的作用,它能够为种子细胞提供生长及物质交换的场所。静电纺丝法作为目前最常用的支架制备方法,其操作简单,制备的支架有极高的比表面积和柔韧的表面性能,其支架结构能够为细胞粘附、繁殖、分化提供足够的空间。在支架材料方面,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是生物医用领域应用最广泛的可降解高分子材料,已广泛应用于药物输送装置和组织工程支架。为了使支架拥有良好的表面亲水性及组织相容性,通常利用聚多巴胺(PDA)涂层处理在支架表面进行功能化修饰,以构建综合性能更优异的细胞移植载体。但目前尚未有研究对PDA涂层的PLGA(PDA-PLGA)支架进行全面的安全性评价并应用到胰岛细胞的体内移植中。本课题将通过静电纺丝法制备PLGA细胞支架,以此为基础,通过聚多巴胺涂层处理对支架进行表面修饰,并对其进行表征,筛选出表面性能和力学性能良好的支架。通过细胞与支架共培养,对PDA-PLGA细胞支架进行体外安全性评价,并分别在大鼠的腹部皮下,腹腔内壁及骨骼肌部位进行支架移植,对支架的体内安全性做出评价。最后将胰岛细胞接种在PDA-PLGA细胞支架上,在糖尿病大鼠的骨骼肌部位进行胰岛细胞的移植治疗,探究其对于糖尿病的治疗效果。以下为本论文的研究内容。1.制备PDA-PLGA细胞支架。本实验部分利用不同分子量大小PLGA,通过静电纺丝技术和聚多巴胺(PDA)涂层处理制备出PDA-PLGA细胞支架。通过检测不同分子量大小的细胞支架的形貌结构、力学性能、水接触角及降解性能,筛选出适合体内移植的纳米纤维支架,结果显示与常规的PLGA支架相比,PDA-PLGA细胞支架的亲水性和拉伸性能得到显著提高,降解时间也得到一定时间的延长;与低分子量的纤维支架相比,高分子量的PDA-PLGA细胞支架有更好的力学性能,且降解时间更长。结果表明,M _W=100 kDa的PDA-PLGA细胞支架更适合做细胞移植的载体。2.PDA-PLGA细胞支架不同移植部位安全性评价。本实验通过细胞水平和动物水平两方面进行评价,在细胞水平,通过脐静脉内皮细胞(HUVEC),巨噬细胞(RAW264.7)等与灭菌后的细胞支架共培养,检测细胞在支架上的增殖情况和粘附情况;在动物水平,将纤维支架分别移植在大鼠的腹部皮下,腹腔内壁,骨骼肌三个不同的位置,通过检测大鼠血清生化指标,支架降解产物乳酸水平,及各脏器及组织HE及Masson染色,进行PDA-PLGA细胞支架的安全性评价。结果显示,PDA-PLGA细胞支架能够促进细胞的生长,且在大鼠的腹部皮下,腹腔内壁和骨骼肌部位进行支架移植均显示出较好的生物安全性,表明PDA-PLGA细胞支架在组织工程领域具有很好的应用前景。同时在骨骼肌部位进行支架移植对大鼠的血清生化指标影响更小,且有利于血管生成,表明骨骼肌作为移植部位具有一定的开发潜力。3.PDA-PLGA支架在胰岛细胞移植治疗中的应用研究。首先将大鼠的胰岛β细胞(RINm5f)与灭菌后的PDA-PLGA细胞支架共培养,通过葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)检测胰岛细胞的分泌功能。将共培养体系中含有胰岛素的细胞上清给予骨骼肌细胞(C2C12)进行共培养,检测骨骼肌细胞的糖消耗和糖摄取的变化。在动物水平,首先通过注射链脲佐菌素(STZ)建立大鼠I型糖尿病模型,将RINm5f细胞接种在PDA-PLGA细胞支架上,在糖尿病大鼠的骨骼肌部位进行移植,通过检测大鼠的空腹血糖变化,和不同时间点的组织切片胰岛素免疫荧光情况,探究胰岛细胞及支架的复合体对糖尿病的治疗作用。结果显示PDA-PLGA细胞支架对胰岛细胞的分泌功能没有影响,PDA-PLGA细胞支架搭载RINm5f细胞在糖尿病大鼠的骨骼肌部位进行移植能降低大鼠血糖,对糖尿病有一定的治疗作用,但14天后治疗效果开始减弱,28天时胰岛素荧光明显变弱,降糖作用基本消失。综上所述,本课题阐明了1.PDA涂层能有效提高PLGA静电纺丝支架的亲水性及力学性能,减慢降解速率,大分子量的PLGA相比于小分子量,更适宜用作体内的移植;2.PDA涂层能促进细胞在支架表面的粘附和增殖。在腹部皮下,腹腔内壁和骨骼肌部位进行支架移植对大鼠生长没有影响,14天后各组的各项检查指标基本无明显差异,且在骨骼肌部位移植对移植初期大鼠的血清生化指标影响更小,PDA-PLGA细胞支架具有较好的生物安全性;3.PDA-PLGA细胞支架对于胰岛细胞的存活和分泌功能没有影响,且胰岛细胞-支架复合物在大鼠骨骼肌部位移植后对糖尿病有一定的治疗作用,但治疗持续时间尚有待进一步研究。