Ⅰ.NP14-UBQ双融合策略提高外源蛋白在植物中的表达;Ⅱ.龙血树斑驳病毒基因组DNA与寄主基因组整合的机制

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1.NP14-UBQ双融合策略提高外源蛋白在植物中的表达融合蛋白策略广泛应用于增加外源蛋白的表达。由于真核生物中存在泛素(UBQ)水解酶(Ubp),利用N端融合UBQ的方法不仅可有效增加蛋白在植物中的表达量,而且该融合蛋白可被Ubp水解,释放出UBQ和完整的非融合形式的目的蛋白。我们发现N端融合CMV CP蛋白N端14肽(NP14)可以更高水平的增加外源蛋白的表达量。通过体外翻译系统证明NP14融合在蛋白质翻译水平上提高了蛋白的表达量。我们将NP14-UBQ序列串联融合于目的蛋白N端,形成双融合蛋白。在体外转录和翻译系统中证明双融合蛋白依然可被准确地水解,释放出非融合形式的目的蛋白。在植物中进行的瞬间表达证明双融合的目的蛋白表达得到了提高。   II.龙血树斑驳病毒基因组DNA与寄主基因组整合的机制我们从富贵竹植物总DNA中通过group PCR和inverse PCR的方法克隆得到一个新病毒的全基因组序列,命名为龙血树斑驳病毒(Dracaena mottle virus,DrMV)。该病毒全长为7,531个核苷酸,GC含量为48.8%,基因组共编码了7个开放阅读框架。其中ORF3编码一个215 kDa的多聚蛋白,内部包含6个明显的保守的基序,分别与病毒的运动,组装和复制相关。它们是:位于aa137-138的运动蛋白基序,位于aa847-862的富含半胱氨酸的锌指RNA结合基序(CXCX2CX4HX4C),位于aa964-990的第二个富含半胱氨酸区域(CX2CX11CX2CX4CX2C),位于aa1150-1157的天冬氨酸蛋白酶基序,位于aa1431-1503的逆转录酶(RT)基序和位于aa1642-1768的RNase H基序。通过编码RT和RNase H的核苷酸序列比对以及ORF的数量、大小、相对位置和序列重叠等分析,作者确定龙血树斑驳病毒(Dracaena mottle virus,DrMV)是一个属于花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)的新病毒种。   通过Immuno-capture PCR(IC-PCR),作者未发现富贵竹植物中存在游离的DrMV病毒粒子。进一步的Southem杂交结果表明,DrMV基因组DNA以整合形式广泛的存在于富贵竹基因组中,整合模式相当保守。在富贵竹基因组中,DrMV DNA会以一种人于全长基因组的形式存在,在Ncol(第2398位核苷酸)到NdeI(第6166位核苷酸)位点之间的序列至少存在2份正向重复的拷贝,形成约1.5倍于DrMV全长的序列。Thermal asymmetric interlaced PCR(TAIL-PCR)和巢式PCR结果还发现,DrMV DNA的第7531位核昔酸与6643位核苷酸相连接,作者还发现DrMV基因组第7522位核苷酸是一个与富贵竹基因组重组的位点。
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