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旋毛虫是一种主要的食源性寄生线虫,旋毛虫病主要是由于生食或半生食含旋毛虫囊包的肉制品从而感染。旋毛虫成虫寄生在宿主的小肠内,但幼虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。蛋白酶能够催化蛋白质多肽链的水解,而在寄生虫体内分泌的有多种功能的蛋白酶,在寄生虫的侵入与致病过程有着重要的作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶Ts SP1.2和丝氨酸抑制因子Ts SPI是从旋毛虫排泄-分泌物（excretory-secretory,ES）中获得的。实验室前期已经发现Ts SP1.2（Gen Bank Accession No.:EU302800）和Ts SPI抑制因子（Gen Bank accession no.XP003377380.1）均可能参与了旋毛虫感染性幼虫侵入小肠上皮细胞（IEC）。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象[1]。本研究的目的是通过RNAi确定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛虫幼虫侵袭和生长发育中的作用。将特异性小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）通过电穿孔法导入旋毛虫肌幼虫（muscle larvae,ML）体内后,分别通过q PCR技术和Western blot技术来验证干扰效果。同时两个基因互为无关基因进行RNAi特异性的研究。此外,选取最优si RNA并导入旋毛虫肌幼虫后,体外观察幼虫存活率并在胆汁激活为肠道第1期幼虫（IL1）后进行侵入实验,观察RNAi沉默Ts SP1.2或Ts SPI是否能抑制幼虫对肠上皮细胞（IEC）的入侵与发育。将RNAi处理后的肌幼虫经口接种感染小鼠,观察沉默Ts SP1.2和Ts SPI对幼虫发育、存活及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞本实验所用旋毛虫均来自本实验室昆明小鼠保种的旋毛虫（T1）。实验所用BALB/c小鼠,雄性6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为本实验室分离出的小鼠小肠上皮细胞。2.Ts SP1.2和Ts SPI的表达纯化及抗其免疫血清的制备将本实验室之前冻存的Ts SP1.2和Ts SPI重组菌活化。进行r Ts SP1.2和r Ts SPI诱导表达,进行超声破碎并纯化蛋白,分别免疫小鼠,获取抗r Ts SP1.2和抗r Ts SPI的免疫血清。3.si RNA的设计及合成根据Ts SP1.2和Ts SPI的基因号,登录si RNA在线设计软件si Direct version 2.0进行设计。每个基因筛选出3个si RNA,根据其位点分别命名Ts SP1.2的si RNA为si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303;Ts SPI的si RNA为si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882。此外,设计一条Control si RNA并添加FAM荧光标记,用于实验观察是否将si RNA导入旋毛虫体内。4.将si RNA用电穿孔法导入到旋毛虫体内应用瞬时电击的方法,分别将2μМ不同si RNA导入到旋毛虫体内,体外培养18h后观察荧光信号。5.RNAi后在基因转录水平和蛋白表达水平的变化将siRNA转染肌幼虫后2、4、6及8天,通过qPCR和Western blot技术分别观察Ts SP1.2和Ts SPI基因转录水平和蛋白表达水平的变化。同时观察不同剂量si RNA（1、2、3μМ）的干扰效果。6.RNAi具有基因特异性分别选取2μМ来自Ts SP1.2和Ts SPI的si RNA进行基因沉默,两组互为对照组,验证RNAi基因特异性。7.RNAi后的虫体存活率及其对虫体侵入IEC的影响电穿孔处理旋毛虫肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态变化,计算存活率。应用电击法将1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-534、si RNA-653和Control si RNA导入到旋毛虫肌幼虫体内,PBS作为对照组。体外孵育2h后观察肌幼虫体外入侵IEC情况,计算RNAi对虫体侵入IEC的抑制率。8.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响将80只BALB/c小鼠分为4组（每组20只）:分别为Ts SP1.2组、Ts SPI组、Control si RNA组及空白对照组。每只小鼠分别按300条肌幼虫进行经口感染。感染后6d后各组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫（AW）,测量雌雄虫长度并计算成虫减虫率,每组分别抽取100条成虫进行体外培养,72h后收集新生幼虫（NBL）,观察NBL虫体长度并计算雌虫生殖力。剩余小鼠在感染后35 d剖杀,收集肌幼虫,测量虫体长度并计算肌幼虫减虫率。结果1.si RNA的导入:通过荧光显微镜下观察,发现RNAi处理后幼虫体内有明显一条荧光且虫体通体发亮,而未处理的幼虫则没有荧光信号。2.RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SP1.2和Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响2.1 RNAi对旋毛虫Ts SP1.2基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot结果显示,si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303处理组肌幼虫Ts SP1.2基因转录水平相对于PBS对照组分别降低了57.05%、47.37%和27.18%（P<0.05）,蛋白表达水平分别减少了69.65%、68.97%和37.09%（P<0.05）;1、2、3μМsi RNA-534导入虫体后,Ts SP1.2基因转录水平降低了44.29%、53.81%和79.16%（P<0.05）,蛋白水平分别减少了35.83%、44.05%和63.28%（P<0.05）;2μM si RNA-534干扰后的肌幼虫在培养2d和4d基因表达量分别降低了56.44%和35.46%（P<0.05）,蛋白水平分别降低了84.48%与67.35%（P<0.05）,Control si RNA与PBS对照组相比较,Ts SP1.2转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。2.2 RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot分析发现,si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882处理组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录水平分别降低了20.50%、42.09%和12.13%（P<0.05）,蛋白表达水平分别减少了63.52%、80.26%和10.61%（P<0.05）;1、2及3μМsi RNA-653导入虫体后1d,Ts SPI基因转录水平分别降低了23.57%、36.90%和60.78%（P<0.05）,蛋白表达水平分别减少了26.47%、75.13%和89.18%（P<0.05）;2μM si RNA-653干扰后的肌幼虫在4d和6d,基因表达量明显降低了75.75%和69.79%（P<0.05）,蛋白表达量分别降低了69.23%和50.63%（P<0.05）。Control si RNA组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。3.RNA干扰的基因特异性分析分别将si RNA-Ts SP1.2和si RNA-Ts SPI导入到幼虫体内后1d,观察RNAi对Ts SP1.2和Ts SPI蛋白表达水平的变化。结果发现,si RNA-Ts SP1.2处理组同PBS组相比,蛋白表达量减少了46.05%,si RNA-Ts SPI组蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）;si RNA-Ts SPI组蛋白表达量相对于PBS对照组减少了20.50%,Ts SP1.2组蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。4.RNAi后的虫体存活率RNAi后1d,si RNA-534、si RNA-653、Control si RNA组和PBS组幼虫死亡率分别为5.16%、4.80%、4.49%及3.16%（P>0.05）。沉默后7d,4组虫体死亡率分别为30.34%、34.08%、33.13%和32.73%（P>0.05）。结果表明RNAi对幼虫的生存能力没有明显的抑制作用。5.RNAi对虫体侵入IEC的抑制作用5.1 Ts SP1.2基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5及3μМ的RNAi实验组与PBS组相比,均显著抑制了幼虫对IEC的侵入,3组的幼虫侵入率分别为42.82%、38.66%和32.88%（χ2 2μM=11.095,χ2 2.5μM=14.892,χ2 3μM=23.878;P<0.01）;RNAi对幼虫侵入IEC的抑制效果与si RNA534的剂量具有相关性（r=0.981,P<0.001）。但是,不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义（P>0.05）。5.2 Ts SPI基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5、3μМsiRNA-653转染旋毛虫体内后1d,3组的幼虫侵入率分别为43.68%、36.07%和30.54%（χ22μM=12.789,χ22.5μM=17.185,χ23μM=28.474,P<0.001）;幼虫侵入率与si RNA653的浓度存在相关性（r=0.976,P<0.001）。不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义（P>0.05）。6.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响6.1 Ts SP1.2-si RNA组:si RNA-534处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷（48.31±7.29）明显低于Control si RNA组（114.15±12.68）和PBS组（112.77±9.99）（Fadults=162.493,P<0.001）;雌成虫培养72h后新生幼虫产量分别为53.33±8.26、78.17±6.33和76.17±6.78条（FNBL=39.547,P<0.001）;感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为1076.40±348.31、3410.79±643.72和3682.34±1090.84（FML=35.530,P<0.05）。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是57.16%和71.46%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度（1496.48±96.19）μm低于si RNA对照组（1807.70±105.88）μm和PBS组（1999.05±36.42）μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为（867.92±28.11）μm与（949.89±20.01）μm,亦明显小于PBS组（996.29±70.27）μm（Ffemal=50.965,Fmale=6.205,P<0.05）。3组的新生幼虫长度分别为（73.72±9.69）μm、（116.50±2.59）μm和（119.28±4.64）μm（FNBL=39.547,P<0.0001）。si RNA组的肌幼虫长度（843.44±39.60）μm亦显著短于对照组的（1133.12±55.54）μm和PBS组的（1146.38±20.70）μm（F=57.836,P<0.001）。6.2 Ts SPI-si RNA组:si RNA-653处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷（440.92±8.29）明显低于Control si RNA组（114.15±12.68）和PBS组（112.77±9.99）（Fadults=191.887,P<0.001）;雌成虫培养72 h后新生幼虫产量分别为（40.67±6.32）、（78.17±6.33）和（76.17±6.78）条（FNBL=112.406,P<0.001）;感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为（1012.29±131.41）、（3410.79±643.72）和（3682.34±1090.84）条（FML=57.014,P<0.05）。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是63.71%和72.38%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度（1517.98±90.74）μm低于si RNA对照组（1807.70±105.88）μm和PBS组（1999.05±36.42）μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为（715.32±57.60）μm与（949.89±20.01）μm,亦明显小于PBS组（996.29±70.27）μm（Ffemal=40.683,Fmale=40.008,P<0.05）。3组的新生幼虫长度分别为（69.85±4.22）μm、（116.50±2.59）μm和（119.28±4.64）μm（FNBL=57.836,P<0.001）。si RNA组的肌幼虫长度（817.44±43.25）μm亦显著短于对照组的（1133.12±55.54）μm和PBS组的（1146.38±20.70）μm（F=39.547,P<0.001）。结论1.应用电穿孔法将Ts SP1.2和Ts SPI特异性si RNA成功导入到了旋毛虫肌幼虫体内。2.Ts SP1.2-si RNA 534和Ts SPI-si RNA 653分别明显降低了Ts SP1.2和Ts SPI的转录与表达。3.RNAi沉默Ts SP1.2和Ts SPI,均显著抑制了旋毛虫对肠上皮细胞的侵入与虫体的发育,并降低了雌虫的繁殖力,进一步证实Ts SP1.2和Ts SPI为旋毛虫的侵入相关蛋白,可作为抗旋毛虫疫苗的潜在的分子靶点。