论文部分内容阅读
随着工农业的发展,大量化学物质的不合理释放对环境造成了极大的污染,其中环境激素对于野生动物和人类的影响尤为严重。针对环境激素三丁基锡(TBT)和滴滴涕(DDT)危害大、分子机理复杂及缺乏高效灵敏性评价系统等问题,我们选择毒理学研究模式生物--原生动物嗜热四膜虫为材料,开展了以下分子毒理学研究:
构建了TBT暴露下的嗜热四膜虫抑制性差减杂交文库(SSH),筛选到101个具有差异表达的EST序列,测序和注释发现它们代表87个基因,实时荧光定量PCR表明质膜钙泵(pmca)、谷胱苷肽(gst)、及NgoA可能参与TBT的解毒代谢。进一一步用全基因组基因表达芯片(microarray)方法考察了TBT暴露下嗜热四膜虫全基因组的基因表达情况,共筛选到明显上调和明显下调的基因161和92个。Blast2GO软件对从SSH和microarray中筛选到的差异表达基因进行功能注释,分别得到60和64个与GOterm相关的基因,但是二者富集比较分析表明两者之间仅在分子功能的分类中有少量共同注释；以microarray筛选得到的GOterms对四膜虫全基因组进行富集分析比较,发现了一些与细胞凋亡(如核酸内切酶、核糖核酸酶)、表达调控(如组蛋白去乙酰化酶、热休克因子、七跨膜受体)和抗逆性(如CAP-Glydomain-containinglinkerprotein、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、半胱氨酸脱硫酶、交替氧化酶)有关的基因,推测TBT暴露下四膜虫可能发生了细胞凋亡并启动多种基因表达调控方式而产生一系列的抗逆功能。
用microarray方法从TBT’暴露下的嗜热四膜虫中筛选到一个被TBT显著诱导表达的热休克蛋白70基因(hsp70-2),将该基因的启动子与报告基因绿色荧光蛋白(GFP)连接到四膜虫rDNA载体。pD5H8中,得到的表达载体HSP702-GFP-pD5H8转染进四膜虫体内,在TBT暴露条件下,该四膜虫绌胞株因hsp7D-2基因启动子驱动下游gfh基因的表达而发出绿色荧光,具有用于环境样品TBT实时监测的应用前景。
用microarray方法考察了DDT暴露下嗜热四膜虫全基因组的基因表达情况,筛选到DDT暴露下明显上调表达的abca2、abcb15和CYP5013C2等基因。实时荧光定量PCR证明这3个基因被DDT特异诱导高表达；亚细胞定位结果表明:ABCA2和ABCB15这2个ATP结合盒转运蛋白(ATP-bindingcassettetransporter,ABCT)定位于细胞膜上,为细胞膜泵蛋白,CYP5013C2这个细胞色素P450酶则定位于细胞质中,为典型的内质网分布特征；在高浓度DDT暴露下,大核基因敲除株Δabca2、Δabcb15、及ΔCYP5013C2的生长速率明显低于野生型,过表达株OECYP5013C2则要高于野生型。推测四膜虫对于DDT的高耐受性,一方面可能来自于细胞膜泵蛋白(如ABCA2与ABCB15)对DDT的泵出,另一方面可能来自于代谢酶(如CYP5013C2)对DDT的转化。