烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型（α7nAChR）属于半胱氨酸环超家族的一员,是一种配体门控阳离子通道。烟碱型乙酰胆碱受体是由五个亚基构成的同源或异源五聚体,而α7nAChR由五个同源的α7亚基构成。与其他亚型的烟碱型乙酰胆碱受体不同的是,α7nAChR广泛分布于中枢神经系统和免疫系统中,在这两个系统中,其又具有不同的生物学特性。研究表明α7nAChR与其他受体亚型不同,在中枢神经系统具有快速激活以及快速脱敏的特性,当该受体的激动剂结合到受体在细胞膜外的配体结合域时,迅速引起中央离子通道的开放,这一过程在毫秒内,之后迅速脱敏,这一过程在100毫秒内。α7nAChR对Ca²⁺具有高通透性,研究表明其对Ca²⁺的通透性是Na⁺的15到20倍。激动α7nAChR可以通过Ca²⁺的内流引起细胞内信号转导,亦可通过非Ca²⁺依赖的途径引起细胞内信号转导。而在免疫系统中,迷走神经的刺激可以引起抗炎作用,这一机制被称为“胆碱能抗炎通路”。研究表明激动巨噬细胞α7nAChR可以引起抗炎反应,减少巨噬细胞促炎性细胞因子的释放。因此α7nAChR在胆碱能抗炎通路中具有重要作用。缺血性脑卒中是由于脑血管狭窄或闭塞导致供血不足引起的脑组织坏死,在全世界范围内尤其是发达国家具有高发病率高死亡率,世界卫生组织统计显示,脑卒中已成为主要致死性疾病以及致残性疾病,给家庭及社会带来沉重的负担。因此探究缺血性脑卒中发生后的病理生理变化,寻找药物治疗新靶点具有重要意义。本实验室前期研究发现,山莨菪碱联合新斯的明可以显著改善小鼠缺血性脑卒中的预后,这一作用主要通过α7nAChR介导。然而α7nAChR对缺血性脑卒中发生后的直接作用及机制并不清楚。本课题第一部分将应用特异性α7nAChR激动剂PNU282987激动α7nAChR,探究α7nAChR对缺血性脑卒中的作用及机制。挤压综合征是由于肌肉含量丰富的部位受到长时间持续挤压,解除挤压后引起的一系列临床综合征,主要由于肌肉组织坏死释放大量有害物质包括钾离子,肌红蛋白等引起的急性肾衰竭,高钾血症,低血容量性休克等症状。挤压综合征常见于地震、泥石流、山体滑坡、交通事故、踩踏等灾难性事件发生时。在进行非战争军事行动医疗救援时,时常会遇到大批量此类伤员。如何进行有效的治疗,减少挤压综合征的死亡率显得尤为重要。肌肉坏死会释放大量有害物质引起全身炎症反应,α7nAChR作为胆碱能抗炎通路中的关键因素,是否可以作为减轻挤压伤综合征的新靶点。山莨菪碱为毒蕈碱型乙酰胆碱受体阻断剂,新斯的明为胆碱酯酶抑制剂,前期研究发现联合应用山莨菪碱和新斯的明可以增加结合到α7nAChR的乙酰胆碱进而产生激动作用。本课题第二部分将联合应用山莨菪碱和新斯的明激动α7nAChR,探究α7nAChR对挤压综合征的作用及机制。（一）α7nAChR改善缺血性脑卒中的预后1、α7nAChR对缺血性脑卒中具有保护作用我们利用野生型小鼠和α7nAChR全身敲除小鼠进行研究,在暂时性大脑中动脉栓塞（tMCAO）缺血性脑卒中模型中观察到,与野生型小鼠相比,α7nAChR全身敲除小鼠神经损伤行为学评分更高,脑梗死体积更大。2、缺血性脑卒中发生后神经元α7nAChR表达水平下降我们利用C57BL/6小鼠构建tMCAO模型,与假手术组相比,脑组织半暗带部分α7nAChR的mRNA和蛋白水平均有显著下降。同时我们利用免疫组织荧光技术共染神经元特异性标记物MAP2和α7nAChR,发现神经元α7nAChR的表达有显著下降。3、缺血性脑卒中发生后α7nAChR调节神经元自噬水平我们利用野生型小鼠和α7nAChR全身敲除小鼠进行研究,构建tMCAO模型后,与假手术组野生型小鼠相比,模型组野生型小鼠LC3水平显著升高,而α7nAChR全身敲除小鼠较模型组野生型小鼠有显著下降。同时我们利用免疫组织荧光技术共染神经元特异性标记物MAP2和LC3,发现模型组野生型小鼠神经元LC3水平较假手术组野生型小鼠显著升高,而模型组α7nAChR全身敲除小鼠这一现象消失。因此α7nAChR的存在可以增强缺血性脑卒中引起的神经元自噬水平。4、缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）环境下原代神经元α7nAChR表达水平下降我们利用RT-PCR、Western Blot以及细胞免疫荧光染色发现,与对照组相比,OGD/R处理后α7nAChR的mRNA及蛋白表达水平显著下降。5、激动α7nAChR可以减轻OGD/R环境对原代神经元的损伤我们利用PNU282987激动α7nAChR检测OGD/R处理后神经元的活力、损伤和凋亡情况。结果显示当PNU282987浓度为100μM时可以产生明显的神经保护作用。6、激动α7nAChR可以增强神经元的自噬水平细胞免疫荧光技术共染MAP2和自噬相关蛋白LC3,结果显示激动α7nAChR可以进一步增强由OGD/R引起的自噬增强。同时Western Blot检测自噬相关蛋白的表达,结果与免疫荧光结果相同,激动α7nAChR可以增强OGD/R环境下原代神经元的自噬水平。此外,我们用mRFP-GFP-LC3过表达慢病毒感染原代神经元,检测自噬流的强弱,结果显示,激动α7nAChR使OGD/R环境下原代神经元自噬流增强。7、自噬可以减轻OGD/R环境对神经元的损伤给予自噬诱导剂雷帕霉素刺激神经元自噬,检测神经元活力和损伤,结果显示OGD/R环境下雷帕霉素引起的自噬减弱了OGD/R对神经元的损伤,增加了神经元活力。8、激动α7nAChR对神经元的保护作用通过自噬发挥在激动α7nAChR的同时,给予神经元自噬阻断剂3-MA,检测神经元活力和损伤,结果显示3-MA阻断自噬后,激动α7nAChR的神经保护作用消失。9、α7nAChR诱导自噬对神经元的保护作用通过AMPK-mTOR-p70S6K信号通路产生我们通过Western Blot检测AMPK-mTOR-p70S6K信号通路中的蛋白磷酸化水平,结果显示激动α7nAChR后,该信号通路磷酸化蛋白p-AMPK显著增加,同时磷酸化蛋白p-mTOR和p-p70S6K显著降低,该通路被激活。我们给予激动α7nAChR的同时,给予AMPK抑制剂Compound C,检测神经元活力和损伤,结果显示,Compound C阻断了OGD/R环境下激动α7nAChR对神经元的保护作用。10、激动α7nAChR降低LPS刺激的BV2小胶质细胞炎症细胞因子的产生我们给予BV2小胶质细胞LPS刺激,同时激动小胶质细胞α7nAChR,利用RT-PCR检测BV2小胶质细胞炎症细胞因子mRNA水平。结果显示激动α7nAChR减少了由LPS刺激引起的BV2小胶质细胞炎症细胞因子的产生。11、激动α7nAChR促进BV2小胶质细胞极化由M1型转化为M2型为探究α7nAChR对小胶质细胞极化的影响,我们利用RT-PCR检测激动α7nAChR后BV2小胶质细胞极化表型标志物,我们同时检测了M1型标志物CD68,CD86以及M2型标志物CD206,Arg1。结果显示LPS可以刺激小胶质细胞极化为M1型,而激动α7nAChR后抑制了小胶质细胞向M1型转化,促进其向M2型转化。同时我们利用细胞免疫荧光技术共染小胶质细胞标志物CD45和CD68,以及CD45和CD206。结果与RT-PCR一致。结论:α7nAChR可以改善缺血性脑卒中的预后,一方面可以通过增强神经元自噬产生神经保护作用,另一方面可以促进小胶质细胞向M2型极化产生抗炎作用。（二）α7nAChR改善挤压综合征的预后1、山莨菪碱和新斯的明联合用药增加挤压综合征大鼠24小时生存率我们构建大鼠挤压综合征模型,并探究给予山莨菪碱和新斯的明单药及联合用药对挤压综合征大鼠24小时生存率的影响。结果显示联合用药高剂量组（20mg/kg山莨菪碱和40μg/kg新斯的明）提高挤压综合征大鼠24小时生存率最为显著。2、山莨菪碱和新斯的明联合用药降低挤压综合征引起的氧化应激水平构建大鼠挤压综合征模型后,给予相应的单药或联合用药治疗,收集大鼠血清和受压肌肉组织,检测了氧化应激相关物质H₂O₂,MPO和总NO,结果显示山莨菪碱和新斯的明联合用药显著降低由挤压综合征引起的氧化应激水平。3、α7nAChR介导了山莨菪碱和新斯的明联合用药对挤压综合征的治疗作用我们利用α7nAChR基因敲除小鼠进行研究,观察联合用药对小鼠24小时生存率的影响。在野生型小鼠中,我们发现山莨菪碱和新斯的明联合用药可以显著提高24小时生存率,而在α7nAChR基因敲除小鼠中这一现象消失。4、山莨菪碱和新斯的明联合用药抑制挤压综合征时的氧化应激和炎症反应通过α7nAChR介导我们检测了挤压综合征小鼠肌肉组织氧化应激和炎症反应水平,结果显示在野生型小鼠中山莨菪碱和新斯的明联合用药可以抑制氧化应激和炎症反应;而α7nAChR基因敲除小鼠中联合用药没有产生这种效果。5、山莨菪碱和新斯的明联合用药对挤压综合征的治疗作用通过α7nAChR激活JAK2-STAT3信号通路介导我们利用Western Blot检测肌肉组织中的JAK2、STAT3总蛋白以及磷酸化蛋白p-JAK2、p-STAT3。C57BL/6小鼠中联合用药可以激活JAK2-STAT3信号通路,而给予α7nAChR阻断剂MLA后,其激活作用消失。在野生型小鼠中亦可观察到联合用药对JAK2-STAT3的激活作用,而在α7nAChR基因敲除小鼠中未观察到此现象。结论:激动α7nAChR可以通过JAK2-STAT3信号通路产生抗炎和抗氧化应激作用,进而改善挤压综合征的预后。本课题揭示了α7nAChR在缺血性脑卒中和挤压综合征中的保护作用及机制,为缺血性脑卒中和挤压综合征的治疗提供了新的靶点,为新药的开发提供了基础理论支持。