副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,为革兰氏阴性细小杆菌或球菌,该菌能引起猪纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎、支气管肺炎和关节炎,严重威胁世界养猪业的发展。副猪嗜血杆菌血清型众多,当前通过血清学方法将副猪嗜血杆菌分为15个标准血清型,其中仍有部分副猪嗜血杆菌不能通过血清学方法分型。由于其存在多种血清型,而且不同血清型或同一血清型的不同菌株之间缺少交叉保护力,灭活疫苗防控效果并不理想。目前治疗和预防该病的主要手段仍是使用抗生素,但随着抗生素的滥用,菌株耐药性正逐年增加。因此,探究副猪嗜血杆菌在中国的优势血清型分布、耐药性变化趋势和筛选潜在毒力因子将为有效防控该病和开发亚单位疫苗奠定基础。本研究从华东地区26个猪场的病猪肺组织中分离到30株副猪嗜血杆菌,对其进行血清型鉴定及耐药性分析,分离得到一株氟苯尼考耐药菌株并成功提取到耐药质粒pHPSGC。之后通过Label-free技术分析了强毒血清型13型和无毒力血清7型两种不同毒力血清型4个菌株的蛋白组成与丰度,筛选了 5个疑似毒力因子Transferrin-binding protein 1(TBP1)、CdtB、htpG、Heme-binding protein A(Heme)、Tublin bindingprotein(TBP)。Western blot结果显示Heme在高毒力菌株中的表达水平显著高于无毒力菌株,最后应用动物免疫实验证明针对Heme的抗体水平同保护力之间成正相关。具体研究如下:1华东地区副猪嗜血杆菌临床分离株血清型分布和耐药性分析2009-2016年本实验室从江、浙、沪、皖地区26家不同猪场送检的病猪肺组织中共分离到30株副猪嗜血杆菌,经PCR鉴定后进行PCR血清分型和微管稀释法进行药物敏感性试验。结果显示血清型7型与13型为优势流行血清型,分别占总菌株数的22.6%和16.1%。所有的副猪嗜血杆菌均对卡那霉素与泰妙菌素耐药,并且绝大多数菌株对庆大霉素(93.3%)、新霉素(90%)和青霉素(90%)耐药,对四环素、阿莫西林、氨苄青霉素、红霉素的耐药率分别为33.3%、50%、40%、23.3%。对氯霉素(10%)、替米考星(6.7%)和壮观霉素(6.7%)的耐药率均低于20%。更重要的是,分离到一株氟苯尼考(3.3%)耐药菌株。另外,所有菌株对头孢噻呋均敏感。我们选取对氟苯尼考耐药的菌株HPSGC进行质粒提取,获得质粒pHPSGC,并通过walking步移法测序后获得其全部序列,长度为5297bp,GC含量为44.82%。鉴定了三个开放阅读框(ORF),对应于基因rep,floR和lysR。序列分析表明,序列分析表明,pHPSGC来源于pHPS1019和pHPSFl之间的同源重组。2副猪嗜血杆菌不同毒力分离株蛋白组成分析副猪嗜血杆菌不同血清型菌株之间毒力存在很大差异,为了揭示不同血清型菌株之间毒力差异产生的原因,本实验通过Label-free技术分析了强毒血清型13型(代表毒株BB、LC菌株)和无毒力血清7型(代表菌株BZ、SY菌株)两种不同毒力血清型4个菌株的蛋白组成与丰度,力图揭示不同毒力副猪嗜血杆菌毒力差异产生的原因,并为亚单位疫苗开发筛选候选因子。本研究从4株副猪嗜血杆菌中共鉴定出17444个肽段,数据库检索显示编码2282个蛋白。蛋白组成分析显示共有1199个蛋白共同存在于这4株菌株中,只有117个蛋白只在13型强毒株中检测到。应用gene ontology对差异蛋白的生物学进程、分子功能和细胞组份进行分析,差异蛋白主要参与细菌代谢、生化反应的催化和细胞组成。本研究的成功开展将为揭示不同血清型菌株之间毒力差异和筛选亚单位疫苗奠定基础。3副猪嗜血杆菌疑似毒力因子的筛选及免疫保护力鉴定副猪嗜血杆菌是导致猪群死亡的重要细菌性病原之一,严重威胁世界养猪业的发展。目前对副猪嗜血杆菌的致病机制研究主要集中于细菌毒力因子的筛选。本研究在前期Lable-free方法分析出强毒株与无毒株之间的蛋白组成差异的基础上,筛选了 5个疑似毒力因子 Transferrin-binding protein 1(TBP1)、CdtB、htpG、Heme-binding protein A(Heme)、Tublin binding protein(TBP)进行深入研究。首先,从基因(DNA)和转录水平(mRNA)确定5个毒力因子在不同菌株基因组中存在和转录情况。其次,将5个毒力因子序列分别连接至pET-32a载体,再将重组质粒克隆至Rosseta表达菌中,蛋白原核表达后,按lmg/mL浓度注射6周龄Balb/c母鼠,0.lml/只,制备多克隆抗体制备。再次,应用纯化的多克隆抗体经通过Western-Blot确定5个毒力因子在不同毒力菌株中蛋白表达水平的差异。结果表明heme-binding protein在强毒力菌株中表达水平显著高于中等毒力和无毒力菌株。对流行毒株heme-binding protein蛋白表达水平进行鉴定进一步确定了该结果。最后攻毒实验中,蛋白组皮下注射浓度为1mg/mL的纯化蛋白;甲醛灭活组皮下注射甲醛灭活的1×1010CFU/mL的5型副猪嗜血杆菌;空白对照组皮下注射PBS,0.1ml/只,结果表明heme蛋白组的免疫保护力优于甲醛灭活组。该研究的成功开展将为以后亚单位疫苗的发展提供了一个新的方向。