研究背景新生儿缺氧缺血性脑损(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指各种围生期窒息而导致脑的缺氧缺血性损害,临床出现一系列脑病的表现,至今仍是造成围产期新生儿死亡和儿童伤残的主要原因之一,但目前尚无理想的治疗方法,因此迫切需要研究HIBD的损伤机制和寻找一种有效的治疗策略。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)作为目前发现的具有高度特异性感受细胞氧分压的调节因子,在缺氧脑损伤的病理生理过程中发挥至关重要的调节作用,参与细胞生存相关的细胞周期的稳定及能量代谢,对缺氧缺血损伤后细胞的存活、凋亡、炎症反应、自噬激活、血管生成的调控等产生重要作用。但目前国内外关于HIF-1α在HIBD早期的水平动态表达变化及其作用和机制的研究报道较少而且研究结论尚不一致。因此,本研究通过建立新生大鼠HIBD模型,观察HIF-1α在HIBD早期的动态表达变化,进一步探讨其可能的作用和机制,为临床研究和治疗新生儿HIBD寻找新的治疗靶点提供理论支持。研究目的本实验通过研究在新生大鼠HIBD早期脑组织中HIF-1αm RNA及其蛋白的表达,观察其水平时间依赖性的动态变化,确定其表达水平最高的时间点。应用HIF-1α抑制剂2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)抑制HIBD后HIF-1α表达上调,观察脑组织病理形态学改变、脑组织含水量变化、细胞凋亡率及其下游促凋亡靶基因BNIP3的表达变化,探讨HIF-1α在HIBD早期可能的作用和机制。研究方法1实验动物及分组出生第一天为P0,日龄为P7的新生Sprague–Dawley(SD)大鼠99只,雌雄不限,体重14.0~18.0 g,SPF级,由河南省实验动物中心提供。1.将36只日龄为P7的SD大鼠随机分为假手术组(Sham,n=6)和模型组(HIBD,n=30),模型组根据处死大鼠时间的不同又分为5个亚组(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h组,n=6)。q RT-PCR、Western blot分别检测Sham组及HIBD组不同时间点HIF-1αm RNA及其蛋白的表达。2.将63只日龄为P7的SD大鼠随机分为3组:Sham组(n=21),HIBD组(n=21),HIBD+2ME2组(n=21),依据实验1的q RT-PCR、Western blot结果,三组大鼠均在HIBD后24 h处死取脑,Western blot检测HIF-1α和BNIP3蛋白的表达,并进行免疫荧光、HE染色、脑组织含水量、细胞凋亡率检测。2模型建立及药物干预参照经典的Rice-Vannucci法制作新生大鼠HIBD模型:结扎左侧颈总动脉并在氮氧混合气体(8%氧气+92%氮气,1.5 L/min)中缺氧2.5 h,每只大鼠的手术时间不超过5 min。Sham组仅游离左颈总动脉,不予缺血缺氧处理。HIBD+2ME2组于模型制作后立即腹腔注射DMSO溶解PBS稀释的2ME2(2ME2给药剂量为15 mg/kg)。Sham组、HIBD组给予等量的DMSO和PBS。3标本制备q RT-PCR及Western blot的标本制备:10%的水合氯醛麻醉后,在冰板上迅速取出左侧脑组织并分成2份标本,分装到无菌无酶的冻存管内,在液氮里速冻后即刻放入-80℃冰箱保存。石蜡切片标本制备:各组大鼠经10%水合氯醛适度麻醉固定后,暴露胸腔进行心脏灌注,先给予50 ml生理盐水灌注,再给予50 ml 4%多聚甲醛灌注,取出整个脑组织后放入4%多聚甲醛固定液内4℃固定24 h,选取视交叉到视丘间的脑组织,进行脱水、石蜡包埋和切片,切片厚约3μm。再将切片脱蜡、水化,进行免疫荧光、HE染色和TUNEL染色。4 q RT-PCR q RT-PCR检测Sham组及HIBD组不同时间点HIF-1αm RNA的表达变化。5 Western blot Western blot检测Sham组及HIBD组不同时间点HIF-1α蛋白的表达变化;及2ME2干预后HIF-1α、BNIP3蛋白的表达变化。6 HE染色石蜡切片脱蜡水化后,经苏木素染色3~5 min,伊红染色1~2 min,中性树胶封片,然后在光学显微镜下观察各组脑组织病理形态学改变。7免疫荧光单标免疫荧光检测各组HIF-1α蛋白的分布与表达的变化。双标免疫荧光检测HIF-1α在缺氧缺血脑组织中与BNIP3、Neu N是否共定位8脑组织含水量测定采用干湿重法测定脑组织含水量。HIBD后24 h 3组大鼠麻醉后处死,取出整个脑后迅速分为缺血同侧脑半球、对侧脑半球和小脑,称量湿重并记录,小脑做内在参照,然后将脑标本放入100℃的烤箱内烘烤24 h至恒重,称量干重并记录。计算脑组织含水量。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。9 TUNEL荧光染色HIBD后24 h进行TUNEL荧光染色,按照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。每个脑组织标本取3张切片,每张切片随机选取缺血侧皮层的5个非重叠高倍镜视野(×400),利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计数TUNEL阳性细胞数和细胞总数,计算凋亡率。10统计学处理应用SPSS 21.0进行统计学分析。数据用均数±标准差(?x±s)表示,多组间的均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验;P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1 q RT-PCR结果Sham组HIF-1a m RNA低表达,HIBD后6 h其表达水平迅速升高,24 h达顶峰(3.38±0.21),后逐渐下降,72 h降至(1.53±0.16);HIBD组每个时间点的表达均显著高于Sham组(P<0.01),且24 h组HIF-1αm RNA表达水平显著高于其它时间点及Sham组(P<0.05)。2 Western blot结果⑴Sham组HIF-1α蛋白低表达,HIBD后6 h其表达水平逐渐升高,24 h达顶峰(2.81±0.36),后逐渐下降,72 h降至(1.37±0.19);HIBD组每个时间点HIF-1α蛋白的表达水平均较Sham组高,且12 h、24 h、48 h组较Sham组显著升高(P<0.01),24 h组HIF-1α蛋白表达水平最高。⑵HIF-1α、BNIP3蛋白的表达水平在Sham组、HIBD组和HIBD+2ME2组3组间的比较差异具有统计学意义(P<0.01);与Sham组比较,HIBD组和HIBD+2ME2组HIF-1α、BNIP3蛋白的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与HIBD组比较,HIBD+2ME2组HIF-1α、BNIP3蛋白的表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3 HE染色结果⑴Sham组:脑组织结构层次清晰,细胞排列整齐、形态正常、细胞核完整清楚,染色均匀。⑵HIBD组:脑组织结构紊乱、间质严重水肿,胞浆疏松、淡染,胞核固缩、碎裂、溶解、核仁消失,可见部分神经细胞出现坏死,胶质细胞相对增多,伴有不同程度的炎性细胞浸润,皮层及海马区域神经细胞明显减少,尤以海马区域更为明显。⑶HIBD+2ME2组:脑组织结构模糊,排列尚规则,间质水肿,伴有少量炎性细胞浸润,可见神经细胞点状变性、坏死,但是病变程度较HIBD组轻。4免疫荧光结果HIF-1α染色阳性细胞数/mm2在Sham组、HIBD组和HIBD+2ME2组3组间的比较差异有统计学意义(P<0.01)。Sham组HIF-1α染色阳性细胞数/mm2较少且HIF-1α蛋白主要在胞浆中表达,HIBD组HIF-1α染色阳性细胞数/mm2较Sham组明显增多(P<0.01)且主要在胞核中表达,HIBD+2ME2组HIF-1α染色阳性细胞数/mm2较HIBD组明显减少(P<0.05)。HIF-1α免疫荧光染色与神经元标志物Neu N免疫荧光染色共定位,HIF-1α免疫荧光染色与BNIP3免疫荧光染色共定位。5脑组织含水量测定结果缺血同侧半球脑组织含水量在Sham组、HIBD组和HIBD+2ME2组3组间的比较差异有统计学意义(P<0.01)。在此基础上进行两两比较,与Sham组比较,HIBD组和HIBD+2ME2组脑组织含水量显著增加(P<0.01),与HIBD组比较,HIBD+2ME2干预组脑组织含水量显著降低(P<0.01);缺血对侧半球三组间的比较(F=2.253,P=0.124)及小脑三组间的比较(F=2.173,P=0.133)差异均无统计学意义。6细胞凋亡率检测结果细胞凋亡率在Sham组、HIBD组和HIBD+2ME2组3组间的比较差异有统计学意义(P<0.01);两两比较发现,HIBD组及HIBD+2ME2组细胞凋亡率与Sham组比较显著增加(P<0.01);与HIBD组比较,HIBD+2ME2组细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。结论1 HIBD可激活HIF-1α在缺氧缺血脑组织中表达,且HIF-1αm RNA及其蛋白表达水平均呈先升高后下降的趋势,并于HIBD后24 h其m RNA和蛋白表达水平最高。2 HIBD后HIF-1α蛋白从细胞浆转移到细胞核,并且其主要在缺氧缺血神经元内表达。3在HIBD早期,伴随HIF-1α、BNIP3表达上调,脑组织病理形态、脑水肿、神经细胞凋亡加重;抑制HIF-1α的表达,BNIP3的表达亦下降,缺氧缺血所致的脑损伤减轻。推测HIF-1α可能通过调控其下游促凋亡靶基因BNIP3的表达介导神经损伤作用