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2型糖尿病是一种由多因素引起的代谢性疾病,以高血糖、胰岛素抵抗为主要特征。2型糖尿病的发病率持续增加,已成为全球最大的公共健康问题之一。研究表明,过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)会引起氧化应激,导致细胞功能障碍,包括能量代谢紊乱、细胞信号受损、细胞转运机制障碍、免疫激活和炎症。慢性氧化应激是导致胰岛素抵抗、代谢失调、糖尿病等疾病发展的潜在因素。因此,抗氧化应激药物的研发是治疗2型糖尿病的新思路。次血红素三肽(Deuterohemin-βAla-His-Lys,Dh HP-3)是本实验室基于天然过氧化物酶(microperoxidase-11,MP-11)设计合成的新型过氧化物酶模拟物。前期研究发现,Dh HP-3能够降低2型糖尿病大鼠血糖,激活PI3K/AKT信号通路抑制高糖诱导的胰岛β细胞凋亡。Dh HP-3因其较短的半衰期及较快的血浆清除率而采用注射给药。注射导致依从性差,且有感染的风险,因此,口服途径仍是最理想的给药方式。基于此,我们设计合成了次血红素六肽(Deuterohemin-βAla-His-Thr-Val-Glu-Lys,Dh HP-6)。前期研究发现,Dh HP-6的相对酶活要高于Dh HP-3。Dh HP-6在人工胃肠液及血浆中具有较高稳定性,且降解产物的相对酶活与Dh HP-6一致。为了探讨口服Dh HP-6对于2型糖尿病的影响,本论文主要从三个方面进行了研究:1.本文通过高脂饮食联合腹腔注射链脲霉素构建了2型糖尿病小鼠模型,从动物水平探究了口服Dh HP-6对于2型糖尿病的影响。结果表明,口服Dh HP-6能够有效降低2型糖尿病小鼠的血糖,改善胰岛素抵抗。血清学研究发现,Dh HP-6能够增强SOD、GSH及CAT的活性,降低MDA的含量,从而降低氧化应激水平;此外,Dh HP-6还能降低T-CHO、TG及LDL-C含量,增加HDL-C的含量,改善2型糖尿病小鼠的血脂紊乱;通过对肝功指标(AST、ALT和ALP)的检测及肝脏形态结构的观察发现,Dh HP-6能够有效维持2型糖尿病小鼠肝脏的功能及结构完整性。同时,通过对胰岛和肾脏形态结构的观察发现,Dh HP-6能够有效改善2型糖尿病小鼠胰岛萎缩及空泡变性,维持肾小球结构完整性。值得一提的是,Dh HP-6能够显著降低2型糖尿病小鼠FBPase和G6Pase含量,升高HK含量;肝脏PAS染色发现,Dh HP-6能够有效促进2型糖尿病小鼠肝脏糖原的合成。通过western blot分析发现,Dh HP-6能够促进IRS-1(Tyr632)、AKT(Ser473)及GSK-3β(Ser9)的磷酸化,抑制IRS-1(Ser307)的磷酸化,激活2型糖尿病小鼠肝脏PI3K/AKT信号通路;同时,Dh HP-6能够促进AMPK的Thr172磷酸化,抑制G6Pase及PEPCK的表达,激活2型糖尿病小鼠AMPK信号通路;此外,Dh HP-6促进了Nrf2的表达,抑制了Keap1的表达,改善2型糖尿病小鼠的抗氧化系统。因此,Dh HP-6能够激活2型糖尿病小鼠PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路,改善其肝脏胰岛素抵抗症状。2.通过葡萄糖胺诱导建立了Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,进一步从细胞水平探究了Dh HP-6改善肝脏胰岛素抵抗的作用机制。研究结果表明,Dh HP-6能够有效抑制葡萄糖胺诱导引起的细胞损伤,促进Hep G2细胞的葡萄糖吸收及糖原合成,抑制ROS的生成,改善线粒体功能损伤。Western blot结果表明,Dh HP-6能够激活Hep G2细胞胰岛素抵抗模型的PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路。当加入PI3K的特异性抑制剂LY294002后,PI3K/AKT信号通路并不能完全被抑制,同时发现,LY294002也能部分抑制AMPK及Nrf2-Keap1信号通路;当加入AMPK的抑制剂复合物C后,AMPK信号通路不能被完全抑制,而PI3K/AKT及Nrf2-Keap1信号通路也被部分抑制。由此可知,PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路并非独立作用,而是相互影响相互促进的。因此,Dh HP-6能够激活PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路改善葡萄糖胺诱导的Hep G2细胞胰岛素抵抗。3.为了进一步探讨Dh HP-6的口服递送策略,我们合成了靶向叶酸受体的叶酸-羧甲基壳聚糖,制备了由Dh HP-6、细胞穿膜肽、叶酸-羧甲基壳聚糖组成的微球,并初步验证了其作为Dh HP-6口服递送系统的可行性。结果表明,相同浓度下,细胞穿膜肽RR-9相较于FI-6和LK-18能够显著降低Caco-2细胞模型的跨膜电阻,降低细胞膜连续性,因此,选用RR-9进行后续实验。叶酸-羧甲基壳聚糖对Caco-2细胞几乎没有毒性,且黏附能力比羧甲基壳聚糖更强。Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球在人工胃液中释放缓慢,在人工肠液中释放显著变快。在Caco-2细胞口服吸收模型中,Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球能够显著促进Dh HP-6的跨膜转运。因此,Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球能够增强壳聚糖对于Caco-2细胞的黏附能力,促进Dh HP-6的跨膜转运。综上,Dh HP-6通过激活PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗;此外,Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球作为Dh HP-6口服递送系统具有可行性。