鸡贫血病毒(CAV)的VP3基因编码的小分子蛋白具有特异性诱导凋亡的能力,称为凋亡素(apoptin)。Apoptin能选择性诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡,而对正常二倍体细胞或原代细胞无作用。其经典的作用机制是Apoptin进入肿瘤细胞核中并定位于细胞核中,并在核内大量聚集,108位苏氨酸磷酸化后,从而诱导肿瘤细胞凋亡。其具有的肿瘤特异性诱导凋亡作用,使得它成为了一种具有抗癌效应的蛋白质,从而具有广阔的发展前景。在实验室前期实验中,我们已经证明PTD4-apoptin融合蛋白在人源肝癌细胞HepG2中的透膜效应,并探讨了该融合蛋白在体内外水平上对HepG2细胞的抑瘤效应。本课题拟以人源宫颈癌细胞HeLa、鼠源宫颈癌细胞U14为对象,研究从包涵体中复性得到的PTD4-apoptin融合蛋白对宫颈癌体内外的抑瘤效果,并观察其是否引起实验动物的免疫反应,从而降低融合蛋白的治疗效果,以及其对机体的正常组织是否具有毒副作用。并且在实验室前期研究的基础上对PTD4-apoptin融合蛋白抑制肿瘤的非经典途径的作用机制进行初步的探讨。在体外实验中,我们将HeLa细胞采用PTD4-apoptin融合蛋白孵育后,取细胞中总蛋白,采用western blotting方法检测融合蛋白透膜情况,发现PTD4能够顺利将apoptin带入细胞中。然后我们采用激光共聚焦观察PTD4-apoptin融合蛋白孵育HeLa细胞后,其在细胞中内定位情况,我们发现在HeLa细胞中,该融合蛋白定位于细胞核内。随后,我们将HeLa细胞孵育PTD4-apoptin融合蛋白,采用MTT和流式细胞术检测肿瘤细胞增值抑制效应,发现PTD4-apoptin融合蛋白能明显抑制HeLa细胞的增殖。在体内实验中,我们在BALB/c裸小鼠背部注射HeLa细胞悬液,建立裸小鼠背部移植瘤的模型。在BALB/c小鼠背部注射U14细胞悬液,建立BALB/c小鼠背部移植瘤的模型。我们将小鼠模型均分为两组,每组分别于移植瘤处涂抹PTD4-apoptin融合蛋白和PTD4-GFP融合蛋白,给药时间分别为7天或21天,并且每天定时测量每只小鼠背部肿瘤大小。给药结束后,处死小鼠,取出小鼠背部移植瘤组织、肝脏和肾脏进行HE染色、免疫组化检测和TUNEL检测。其瘤体组织、肝脏和肾脏组织中均能检测到PTD4-apoptin融合蛋白和PTD4-GFP融合蛋白,但是TUNEL检测结果中只有涂抹PTD4-apoptin融合蛋白的肿瘤组织中有明显的阳性,证明该组织中发生了明显的凋亡效应。而其它组织均为阴性结果,则证明该融合蛋白对肝脏和肾脏并没有明显的毒副作用。同时,为了观察外源性融合蛋白是否会激活BALB/c小鼠免疫系统,我们还提取BALB/c小鼠T淋巴细胞和血清,采用流式细胞仪和ELISA法,进行BALB/c小鼠T淋巴细胞分选、TNF-a细胞因子检测和γ-IFN细胞因子检测。T淋巴细胞分选结果显示,涂抹PTD4-apoptin融合蛋白的荷瘤BALB/c小鼠的T淋巴细胞并未被明显活化。通过TNF-a细胞因子检测和γ-IFN细胞因子检测我们发现,涂抹PTD4-apoptin融合蛋白的荷瘤BALB/c小鼠血清中细胞因子表达水平并没有明显的变化。随后,我们采用WST法检测PTD4-apoptin融合蛋白对BALB/c小鼠T淋巴细胞的增殖抑制作用,我们发现孵育PTD4-apoptin融合蛋白的BALB/c小鼠T淋巴细胞并没有发生明显的增殖作用或者生长抑制作用。上述体内实验的结果表明,采用涂抹方式给药的PTD4-apoptin融合蛋白,具有肿瘤特异性而且对其它非肿瘤组织并没有明显的毒性作用,对BALB/c小鼠T淋巴细胞没有明显毒副作用,也没有引起实验小鼠明显的免疫反应。同时,我们将PTD4-apoptin融合蛋白与HeLa细胞孵育后,采用western blotting检测caspase-3、Bcl-2的变化,发现PTD4-apoptin融合蛋白可激活caspase-3,但是对Bcl-2的表达没有影响。随后,我们将PTD4-apoptin融合蛋白与HepG2细胞孵育后,采用western blotting检测,发现PTD4-apoptin融合蛋白可上调CYLD的表达,下调NF-κB的表达。我们的前期实验结果表明,miRNA19与CYLD、NF-κB可形成前反馈环(feed-forward loop, FFL)。所以,我们将HepG2细胞与PTD4-apoptin融合蛋白孵育,提取细胞中RNA,采用miRNA特殊的颈环结构引物进行qPCR检测,发现孵育PTD4-apoptin融合蛋白后,miRNA19的表达明显下调。从而,我们认为PTD4-apoptin融合蛋白对CYLD蛋白表达的上调和对NF-κB蛋白表达的下调可能是通过PTD4-apoptin融合蛋白对miRNA19表达的下调来发挥作用的。综上所述,PTD4-apoptin融合蛋白在PTD4的介导下,进入HeLa细胞,并定位于HeLa细胞核中,并发挥其凋亡诱导作用。经过裸小鼠和BALB/c小鼠宫颈癌移植瘤的涂抹实验发现,PTD4-apoptin对宫颈癌移植瘤具有明显的肿瘤抑制作用。采用涂抹给药,对正常组织并无明显毒副作用,也不会引起实验小鼠明显的免疫反应。同时,我们发现PTD4-apoptin融合蛋白可激活HeLa细胞中caspase-3,但是对Bcl-2的表达并无影响。在HepG2细胞中,PTD4-apoptin融合蛋白可上调CYLD的表达,相反,也可下调NF-κB的表达。而这一调控作用可能是通过PTD4-apoptin融合蛋白下调miRNA19的表达来发挥作用的,为深入探讨apoptin凋亡诱导效应的作用机制提供了新的线索和途径。