【摘 要】
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在真核生物细胞间期,核膜孔复合物(Nuclear pore complex,NPC)负责调控细胞核和细胞质之间的分子交换,一个功能性的NPC结构由大约30种核膜孔蛋白(Nucleoporins,Nups)构成。当细胞进入有丝分裂期,伴随核膜裂解和NPC解聚,Nups分散在细胞质。之前,学者普遍认为从核膜解聚到核膜重新形成这段时间内,Nups并不发挥生物学功能。但是,陆续的研究表明,Nups参与了有
【基金项目】
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国家自然科学基金(No.31972533) ;中央高校基本科研业务费专项资金(No.2662020DKPY011)
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在真核生物细胞间期,核膜孔复合物(Nuclear pore complex,NPC)负责调控细胞核和细胞质之间的分子交换,一个功能性的NPC结构由大约30种核膜孔蛋白(Nucleoporins,Nups)构成。当细胞进入有丝分裂期,伴随核膜裂解和NPC解聚,Nups分散在细胞质。之前,学者普遍认为从核膜解聚到核膜重新形成这段时间内,Nups并不发挥生物学功能。但是,陆续的研究表明,Nups参与了有丝分裂的重要事件,包括纺锤体组装、染色体排列和分离、动粒-微管(kinetochore-microtubule attachment,K-MT)连接和纺锤体组装检验点(spindle assemble checkpoint,SAC)活性等重要细胞事件。相比体细胞有丝分裂,卵母细胞减数分裂更容易发生纺锤体组装和染色体分离错误,而目前关于卵母细胞减数分裂的分子机制研究并不十分完善,因而本研究探索了Nups在减数分裂成熟过程中的作用及其具体机制。Nucleoporin35(Nup35)和Ribonucleic acid export 1(Rae1)是重要的Nups家族成员,均参与了有丝分裂的纺锤体组装、染色体排列、SAC活性过程。本研究通过小RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,分别敲低Nup35或Rae1,并运用免疫荧光和激光共聚焦、蛋白质免疫印迹、荧光实时定量PCR和染色体爬片等方法来研究Nup35和Rae1在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的亚细胞定位规律和表达模式,以及其所发挥的作用和机制,具体研究结果如下:1.Nup35在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用和调控机制研究(1)免疫荧光结果显示,在生发泡期(germinal vesicle,GV),Nup35聚集于核膜边缘,恢复减数分裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)后,Nup35与纺锤体微管共定位,随减数分裂过程显示出动态的定位模式。在第一次减数分裂前中期(pro-metaphase I,pro-MI),第一次减数分裂中期(metaphase I,MI),以及第二次减数分裂中期(metaphase II,MII)聚集于整个纺锤体,而在第一次减数分裂后期(anaphase I,AI),第一次减数分裂末期(telophase I,TI)定位于纺锤体极。进一步研究发现,破坏纺锤体微管聚集导致Nup35在纺锤体上的定位也消失,说明Nup35的微管动态定位依赖于纺锤体结构的完整。通过免疫印迹,探究Nup35在减数分裂成熟过程中的相对表达模式。结果表明,Nup35在卵母细胞减数分裂过程中呈现稳定的表达,但减数分裂恢复后,Nup35的分子量升高,推测Nup35发生翻译后修饰。(2)利用卵母细胞胞质内显微注射小RNA干扰片段(Si RNA)来敲低Nup35表达,再进行体外成熟培养。结果表明,敲低Nup35不影响卵母细胞GVBD率(P>0.05),但是却显著降低小鼠卵母细胞第一极体排放(polar body extrusion,PBE)(P0.05),但是诱导染色体排列和K-MT连接异常(P0.05),但是导致Securin表达显著降低(P0.05)。染色体爬片的结果显示,敲低Rae1对SAC的重要组分(Bub R1和Mad1)定位模式无显著影响。因而,Rae1调控MI期卵母细胞中Securin的蛋白水平,进而影响染色体排列和非整倍性。总结:Nup35通过调控p-ERK1/2定位和SAC活性,参与纺锤体组装,染色体排列,及第一极体排放。Rae1调控GVBD过程,且通过调控Securin的蛋白水平,影响染色体排列和非整倍性。
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