通过基因工程技术，可以人为地改变天然蛋白质某些性质，增强它们对不良环境的适应，创造出天然蛋白不具备的某些优良特性甚至表现出新的活性，即在分子水平上，对特定的基因或蛋白质进行定向进化。裂殖酵母ABC(ATP-BindingCassette)转运蛋白家族中的bfr1(brefeldinAresistance)是多向耐药亚族的一员，是细胞中多种抗生素的外排泵，能够将咖啡碱跨膜运输到胞外。本文利用易错PCR技术对bfr1基因进行随机突变，构建突变文库，真核表达，以及对耐受咖啡碱的酿酒酵母菌株的筛选鉴定等研究，取得以下主要结果：　　 (1)应用Gateway技术，BP反应得到bfr1基因的入门克隆pENTR-bfr1；选用大肠杆菌-酵母穿梭表达载体pAG413-GPD-ccdB，LR反应构建bfr1酵母表达载体pAG413-bfr1，在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1菌株中表达。以野生型INVSc1菌株为对照，考察不同浓度的咖啡碱对转化酵母菌株的生长影响。结果表明，随着咖啡碱浓度的升高，酵母菌生长受到的抑制越来越强烈，在含8mg/mL咖啡碱的培养基中，野生型酵母几乎不生长，而转化bfr1基因的菌株生长缓慢，受到咖啡碱的抑制减弱。　　 (2)通过易错PCR技术，选择预期得到2.7bp/1000bp突变率的反应条件，对质粒pENTR-bfr1上bfr1基因进行随机突变，将PCR产物与酵母表达载体pAG413-GPD-ccdB连接，获得随机突变质粒pAG413-bfr1，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建了原始库容为106的bfr1随机突变文库。　　 (3)将bfr1随机突变文库转化酿酒酵母INVSc1，培养在分别添加10、15mg/ml咖啡碱的SD-His培养基中。经过大量筛选，最终得到INVSc1突变株pAG413-bfr1-B，能够耐受10mg/mL的咖啡碱。对该突变株测序，比对分析，全长DNA序列有13个碱基突变，突变率为0.28％，其中有10个碱基转换，3个碱基颠换。除去第829位和1198位氨基酸发生同义突变，全bfr1分子有11个氨基酸突变，突变率为0.72％。　　 (4)利用定点突变进一步确定有益突变。突变株pAG413-bfr1-B的突变位点及蛋白结构分析为定点突变的理性设计奠定基础。根据突变位点序列，设计三对寡核苷酸突变引物，使用NlEBPhusion高保真DNA聚合酶，通过PCR反应将突变引入pAG413-bfr1中，产生S36(site1)、D340(site2)、Y497(site3)三种定点突变。然后用DpnI酶切PCR产物除去模板DNA，取适量酶切产物转化大肠杆菌超级感受态细胞XL1-Blue，随机挑选转化子进行测序，结果表明三个单位点都发生了突变，突变率达到100％。经过筛选鉴定，得到能耐受10mg/mL的咖啡碱突变株site-mut2，说明bfr1编码的第340位密码子由天冬氨酸(GAC)残基变为甘氨酸(GGC)残基，增强了bfr1蛋白对咖啡碱的外排，提高了酿酒酵母对咖啡碱的抗性。