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背景和目的随着糖尿病病人的增多,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发病率亦呈上升趋势,目前已成为我国终末期肾脏病的重要原因。由于糖尿病肾病存在着复杂的代谢紊乱,一旦发展到终末期肾脏病,与其他肾脏疾病相比,在治疗上更加棘手。因此及时防治对于延缓糖尿病肾病的意义重大。系膜细胞作为肾脏的固有细胞,具有分泌细胞基质、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质及类似平滑肌细胞收缩的功能,在糖尿病肾病的发生发展中起着重要的作用。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是先天免疫系统的一类受体,其通过检测病原体危险相关的分子模式从而启动炎症反应。研究证明,TLR4信号通路在糖尿病肾病中起着重要的作用,TLR4信号通路的激活可以开启一系列的炎症反应,促使肾脏中的免疫细胞或者其他固有细胞产生炎症因子,从而诱导TGFβ1信号通路的激活,促进肾脏发生纤维化,进一步加剧肾脏的损伤。褪黑素(Melatonin,MT)是由松果体中昼夜节律产生的吲哚,它不但具有抗氧化效果,同时还具有一定抗炎特性。本研究采用MT作用于高糖刺激的小鼠肾小球系膜细胞,分别从细胞和分子水平观察TLR4信号通路与肾脏炎症,纤维化的关系,探讨TLR4信号通路在DN的发生发展的作用机制及MT对TLR4信号通路的干预作用,为DN的防治提供新的思路。方法小鼠系膜细胞为购自中科院细胞库的SV 40 MES 13。CCK-8试剂盒检测MT干预及高糖刺激对SV 40活力的影响。在不同的高糖刺激时间,不同浓度高糖刺激,以及不同浓度MT干预下通过观察TLR4蛋白表达量的变化,优化实验条件。实验分组:甘露醇渗透压对照组(Mannitol),正常对照组(LG),正常对照+MT组(LG+MT),高糖组(HG),高糖+10μM MT组(HG+10μM MT),高糖+100μM MT组(HG+100μM MT),高糖+1000μM MT组(HG+1000μM MT),高糖+TLR4抑制剂组(HG+TAK242)。在相应的刺激时间点收集细胞和细胞上清。EdU试剂盒检测高糖刺激MT干预,以及TLR4抑制剂对SV40的增殖功能的影响;激光共聚焦显微镜下观察各组TLR4、ColⅣ及FN的表达情况和NF-κBp65核转移的情况;ELISA试剂盒检测各组细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、MCP-1、ColⅣ及Fn的表达情况;实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR)测定各组细胞中TLR4、IL-1β、TNF-α、MCP-1、ColⅣ及Fn的mRNA转录表达;Western blot检测各组总蛋白中TLR4、MyD88、Trif、p-IRF3、IRF3、I-κB、pI-κB、TGFβ1、Smad3、pSmad3、ColⅣ和Fn的蛋白表达。结果(1)与对照组相比,实验使用浓度的MT对高糖刺激的SV40活力无明显影响(P>0.05)。(2)EdU方法显示高糖可以刺激系膜细胞增殖,MT干预和TLR4抑制剂均可抑制高糖刺激导致的系膜细胞增殖。(3)激光共聚焦显微镜示,与LG组比较,甘露醇组和LG+MT组TLR4、ColⅣ及Fn的表达无明显差异,NF-κBp65核转移无差别;高糖刺激可使细胞TLR4、ColⅣ及Fn的表达明显增加,NF-κBp65核转移现象明显增多;MT干预与TLR4抑制剂均可高糖刺激导致的上述现象下调,并且MT的抑制作用呈浓度依赖性。(4)ELISA方法检测显示,与LG组相比,甘露醇组和LG+MT组细胞培养基中所含的IL-1β、TNF-α、MCP-1、ColⅣ及Fn量无明显差异,HG组明显增高(P<0.05),与HG组比较,MT干预及TLR4抑制剂组细胞培养基中IL-1β、TNF-α、MCP-1、ColⅣ及Fn含量明显下降(P<0.05),并且MT的干预程度呈浓度依赖性。(5)PCR法检测结果显示,与LG组比较,甘露醇组和LG+MT组TLR4、IL-1β、TNF-α、MCP-1、ColⅣ及Fn的mRNA表达无明显差异,HG组上诉mRNA表达明显增加(P<0.05),与HG组相比,MT干预与TLR4抑制剂的使用均可下调上述mRNA的表达(P<0.05)。(6)Western blot显示,与LG组相比,甘露醇组和LG+MT组的TLR4、MyD88、Trif、p-IRF3、pI-κB、TGFβ1、Smad3、pSmad3、ColⅣ和Fn的蛋白表达无明显差异,HG组的上述蛋白表达明显增强(P<0.05),与HG组比较,MT干预及TLR4抑制剂的使用可使上述蛋白表达明显下降(P<0.05),并且MT的干预程度呈浓度依赖性。结论高糖环境下,SV40的TLR4及下游信号表达上调,导致炎症因子的表达增加,从而导致TGFβ1信号通路的激活,导致SV40的细胞外基质ColⅣ和Fn分泌增加,MT干预及TLR4抑制剂的应用可抑制上述信号通路的激活,下调系膜细胞细胞外基质的分泌。