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本论文选取分布于中国各地有争议的三个分类群的“罗布麻”植物样本作为实验材料,采用改进Qiagen法从干燥和标本叶片中提取到完整的基因组DNA,运用ITS、tmL内含子与trnL-F间隔区以及RAPD等分子标记技术探讨我国三种“罗布麻”的问题和亲缘关系:利用PCR产物直接测序法和RAPD-SCAR法分别对罗布麻及其易混品进行分子鉴定;并对罗布麻和大叶白麻野生居群分别进行RAPD遗传多样性分析。主要研究内容和结果如下:
1.不同保存状态“罗布麻”叶片基因组DNA的提取参照从乙醇保存的动物样本中提取基因组DNA的方法,采用Qiagon植物基因组DNA提取试剂盒,并在核裂解之时加入木瓜蛋白水解酶37℃温浴振荡水解12小时,以去除蛋白质释放DNA,后续步骤按照Qiagen说明书的方法。按照这一方法从不同生长季节(取材时间从2005年7 月~2005年10月)与不同贮存方法(硅胶干燥、自然干燥与18年前的常规压制标本叶片)的三种“罗布麻”叶片中均提取出完整的基因组DNA。
2.“罗布麻”的分类问题与亲缘关系研究(1)测定了罗布麻、白麻和大叶白麻的核糖体DNA ITS序列、叶绿体trnL内含子与trnL-F间隔区序列,并结合GenBank中相关属种植物的ITS、tmL内含子与trnL-F间隔区(含外类群)对我国产“罗布麻”的系统分类问题进行了分析。结果表明:罗布麻、白麻和大叶白麻都应属于罗布麻属,而且它们之间的亲缘关系较罗布麻属内其他植物种间的亲缘关系更近。(2)对来源于9个省份的10个罗布麻居群样本和3个省份的5个大叶白麻居群样本进行RAPD-PCR检测,分析罗布麻和大叶白麻种间和居群间的遗传距离、相似度、多样性指数,并进行系统聚类,结果显示,罗布麻和大叶白麻的亲缘关系超出了同一个种内不同居群间的关系,应为罗布麻属(Apocynum)内亲缘关系较近的两个种。
3.罗布麻及其近缘相似种的分子鉴定研究(1)利用PCR产物直接测序法对罗布麻及其易混品大叶白麻和(Apoacnum cannabinum)的核基因组(rDNA)ITS区与叶绿体基因组(cpDNA)trnL内含子及trnL-F间隔区序列进行比对。结果显示:罗布麻和大叶白麻ITS序列完全一致,与A.cannabinum在ITS1区有13个位点、在ITS2区有10个位点不同;在trnL内含子区及trnL-F间隔区,罗布麻和大叶白麻共有3个位点不同,罗布麻和A.cannabinum间共有23个位点、大叶白麻和A.
cannabinum间共有20个位点不同。研究表明,依据ITS区序列可鉴别A.cannabinum和国产“罗布麻”(罗布麻与大叶白麻);利用trnL内含子及trnL-F间隔区序列可鉴别罗布麻、大叶白麻和A.cannabinum。(2)用80条RAPD随机引物对罗布麻和大叶白麻不同居群样本扩增,筛选出两条罗布麻特异片段B08-407和B03.1368;片段经克隆测序,并根据所测序列设计SCAR引物,其中B03-1368SCAR引物在退火温度59℃时,将罗布麻和大叶白麻简便、准确鉴别开来,将此SCAR标记命名为SCB03-1368。
4.罗布麻与大叶白麻野生居群遗传多样性分析(1)利用RAPD分子标记技术对采自我国8个省份的9个罗布麻野生居群的遗传多样性进行检测。结果表明,罗布麻具有较高的遗传多样性水平,遗传分化主要发生在居群间。居群间遗传距离与聚类结果显示各居群间的亲缘关系与地理分布和环境特征有一定的相关性。根据引物B03产生的标记识别码可以有效鉴别罗布麻9个居群。(2)对分布于新疆、甘肃和青海三地的5个大叶白麻野生居群进行RAPD遗传多样性分析,结果也发现,大叶白麻遗传多样性水平并不低,居群间的遗传分化水平远高于居群内。聚类分析显示居群问的相似度与分布区的地理和气候特征相关。建议在利用罗布麻和大叶白麻资源时,根据各个居群的品质和遗传特征,对多个居群及其生境加以保护。