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目的探讨津血源治疗干燥综合征的中医理论及物质基础;在蛋白和基因水平探讨津血源及其标志性单体对M3-Ca2+-AQP5途径的作用特点,以了解其对颌下腺细胞的不同部位AQP5的表达差异,从而进一步了解其作用位点;研究津血源及其标志性单体对颌下腺细胞膜钙、钾离子通道的影响,探讨其对增加外钙内流及促进内钙释放的机制。方法理论研究分成两个部分,分别为干燥综合征的中西医研究进展和对“津血同源”理论的分析、津血源组成药物的分析及方义、临床研究基础。实验研究分为四个部分。第一部分为观察津血源及其标志性单体对急性口干症模型鼠颌下腺细胞腺泡细胞膜及分泌小管AQP5分布的影响。首先制作急性口干症动物模型,将实验动物分为正常大鼠组、阿托品造模组、4-DAMP造模组、阿托品/4-DAMP+cevimeline组、阿托品/4-DAMP+津血源组、阿托品/4-DAMP+丹酚酸A组、阿托品/4-DAMP+芍药苷组、阿托品/4-DAMP+麦冬皂苷D组,采用免疫组化法研究各组大鼠颌下腺腺泡细胞膜表面及分泌小管AQP5分布,以了解津血源及其标志性单体作用的受体类型(M3受体)与细胞膜表面及分泌小管AQP5动态变化的关系。第二部分,进一步研究津血源及标志性单体对大鼠颌下腺腺泡细胞的顶质膜(APM)、基侧膜(BLM)和细胞内膜(ICM)AQP5蛋白表达量的影响。动物模型制作和分组与第一部分相同。Western blot法分析研究津血源及其标志性单体对腺泡细胞膜的不同膜成分上M3-AQP5的变化影响。第三部分研究津血源及标志性单体对大鼠颌下腺腺泡细胞不同膜成分AQP5mRNA表达量的影响。分组为生理盐水组、4-DAMP组、Staurosporine 组、TMB-8 组、阿托品组、H-7 组、4-DAMP+津血源组、H-7/4-DAMP/TMB-8/Staurosporine+cevimeline/麦冬皂苷 D/芍药苷组/丹酚酸 A 组、H-7/TMB-8/Staurosporine+津血源/cevimeline组,PCR法测不同组大鼠颌下腺细胞顶质膜(APM)、基侧膜(BLM)和细胞内膜(ICM)AQP5mRNA表达量的差异,从而确定M3-Ca2+-AQP5途径对AQP5mRNA转位过程的影响。第四部分,重点考察津血源标志性单体对颌下腺细胞钙、钾通道及电流的影响。通过急性分离大鼠颌下腺细胞,采用膜片钳技术观察麦冬皂苷D/芍药苷和丹酚酸A对钙、钾离子通道的作用特点,分析三类单体对M3-Ca2+-AQP5途径中离子通道的影响。结果1.理论研究结果中医古籍无干燥综合征这一病名,根据其病因病机、临床表现、导师临证经验和临床疗效研究基础,可以用“津血同源”理论指导干燥综合征的临证辨治。结合既往研究基础,提出以“津血同源”理论立方的津血源及其标志性单体的疗效可能与其影响唾液腺津液代谢的M3-Ca2+-AQP5途径有关。2.实验研究结果2.1从形态学方面揭示了津血源及其标志性单体可明显增加对M受体阻断(阿托品造模)以及选择性M3受体阻断(4-DAMP造模)的腺泡细胞膜及分泌小管的AQP5表达,芍药苷的作用最强,麦冬皂苷D次之,两者均强于M3受体激动剂cevimeline的作用,津血源的作用比cevimeline略弱。2.2津血源、芍药苷、麦冬皂苷D及cevimeline可以明显增加M受体阻断以及选择性M3受体阻断的颌下腺细胞顶质膜上AQP5蛋白的表达量。芍药苷组AQP5蛋白的表达量最高,其次分别是麦冬皂苷D组、cevimeline组、津血源组。2.3正常情况下,腺体细胞APM上AQP5mRNA的表达量是最高的,基侧膜(BLM)次之,细胞内膜(ICM)最少。津血源、芍药苷、麦冬皂苷D及cevimeline可以明显上调M3受体阻断、非选择性M受体阻断、蛋白激酶C抑制、胞内钙离子释放抑制组颌下腺细胞APM上AQP5mRNA的表达,基侧膜(BLM)次之,细胞内膜(ICM)增加不明显。2.4 100μmol/L麦冬皂苷D与100μmol/L芍药苷可以增加细胞峰电流,促进颌下腺细胞钙通道的开放。芍药苷还能减弱钙依赖的钾电流。结论:在理论方面,津血互为转化及输布异常、两者互为病理因素与原发性干燥综合征的发病机制与预后相关,以“津血同源”理论,可指导以口眼干燥等外分泌腺受累为主的干燥综合征的辨治。实验研究方面,正常情况下或阻断M受体、抑制胞内钙离子等病理状态下,腺体细胞APM上AQP5的表达量是最高的,BLM次之,ICM最少。津血源、芍药苷、麦冬皂苷D、及cevimeline可以明显上调APM上AQP5mRNA的表达,可以推测这一转位过程涉及激动M3受体,促进颌下腺细胞钙离子通道开放,增加胞内Ca2+浓度,从而使AQP5在APM表达增加,导致涎腺分泌唾液增加。