Arthrobacter sp.DNS10与Enterobacter sp.P1协同缓解阿特拉津对大豆胁迫的机制研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:cgz1987
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除草剂阿特拉津以其价格低廉、除草效果好等优点被广泛用于玉米农田中杂草的防除。由于阿特拉津具有生物毒性和残留时间长等特点,因此其大量施用对土壤质量造成了严重的危害。此外,残留在土壤中的阿特拉津也可对大豆等后茬敏感作物的生长造成影响,因而威胁粮食安全。此外,我国农田土壤中总磷含量较高,但能够被植物利用的有效磷含量相对较低,由此引起磷肥的不合理使用并引发一系列污染问题。针对上述农业生产过程中的实际问题,本研究选取阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10和解磷菌Enterobacter sp.P1为菌种资源,在明确菌株P1解磷能力的基础上,重点研究了共同培养条件下复合菌群生长以及阿特拉津降解特性,并探讨了相关协同降解机制;同时通过盆栽试验的方式,进一步考察上述菌株联合作用缓解残留阿特拉津对大豆的胁迫的作用效果与生物学机制。上述研究结果将为有关复合菌群的原位修复以及解决由阿特拉津引起的轮作障碍提供必要理论依据与技术支撑。主要研究成果如下:(1)解磷菌P1在培养18 h后达到稳定期,菌体量达到(2.03±0.11)×108 cfu·mL-1。培养液pH在24 h由8.31±0.01下降至4.72±0.03研究发现菌株P1主要通过分泌苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和柠檬酸等低分子量有机酸的方式来溶解无机磷,培养至27h培养液中有效磷含量达到最大值110.36±3.19 mg·L-1。(2)对阿特拉津降解菌DNS10和解磷菌P1之间的交互作用进行了评价。在以100 mg·L-1阿特拉津为唯一氮源的基础无机盐培养液中对上述菌株共培养48h后,发现复合菌群对阿特拉津的降解率达到99.18±1.00%,而菌株DNS10单独培养条件下的阿特拉津降解率仅38.57±7.39%;共培养与单一培养条件下降解产物三聚氰酸浓度分别为63.91±3.34 mg·L-1和26.60±3.87 mg·L-1。此外,共培养处理培养液pH值在培养的第36-48h由6.78±0.02降低至5.10±0.29,而菌株DNS10和菌株P1单独培养处理的pH值在上述阶段则无明显变化,共培育条件能够促进两株微生物生长阿特拉津降解与解磷能力。共培养条件下阿特拉津降解基因trz N,atzB和atzC的表达量是菌株DNS10纯培养条件下的3.35-6.61、1.10-1.81和2.94-3.09倍(36h-60h)。(3)采用底物利用实验,探讨共培养条件下菌株DNS10和菌株P1底物利用潜在特性。结果表明,菌株P1不能够利用阿特拉津生长,但在以阿特拉津代谢产物乙胺或异丙胺为唯一氮源的条件下菌株P1的OD600分别从0.024±0.001、0.025±0.001上升至0.043±0.002、0.043±0.000,并且发现培养液的pH分别从7.27±0.02、7.30±0.01降低至4.37±0.02、4.45±0.03。此外,研究发现柠檬酸(0.3 mg·L-1)可以提高菌株DNS10的生长与降解能力,其中降解率较未添加柠檬酸的处理相比提高6.43%。通过半透膜分离培养使两株菌能够利用共培养体系中的底物,同时避免两株菌直接接触进一步验证共培养条件下菌株DNS10和菌株P1可利用彼此的代谢产物进行生长。结果共培养处理中培养至24 h时菌株DNS10的OD600为0.428±0.036,菌株P1为0.093±0.006,纯培养处理中菌株DNS10OD6000.320±0.025,菌株P1没有生长。而且,24 h共培养处理中阿特拉津完全被降解,而菌株DNS10纯培养降解率仅88.10±1.36%,共培养处理中接种菌株P1的培养液pH从6.85±0.00下降至6.09±0.13,而纯培养处理接种菌株P1的培养液没有降低,进一步说明了两种菌可利用对方的代谢产物。(4)考察菌株DNS10与菌株P1联合修复对阿特拉津胁迫下大豆幼苗生长和生理情况的影响。结果表明,联合修复处理与菌株DNS10单独修复相比大豆幼苗生物量上升7.26±0.51%。联合修复处理大豆幼苗叶片中阿特拉津积累量明显低于菌株DNS10单独修复处理。从大豆幼苗根和叶的亚显微结构能够看出,联合修复处理中叶绿体和线粒体机结构和功能更加完整,并且联合修复的处理大豆叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量分别为0.36±0.02mg·g-1和0.18±0.11 mg·g-1,明显高于菌株DNS10单一修复处理。阿特拉津胁迫会对大豆幼苗体内造成明显的膜脂过氧化,这激活了大豆幼苗叶片中的抗氧化防御体系。未接种阿特拉津降解菌的污染处理,叶片中SOD、POD活性明显高于未受到阿特拉津污染的对照,而联合修复处理中大豆叶片中各种抗氧化酶活性接近未受污染的空白,说明联合修复能减少阿特拉津对大豆幼苗叶片的胁迫作用,其中联合修复的处理中SOD活性为83.55±5.69 U·g-1FW,菌株DNS10单独修复处理为110.95±8.85 U·g-1FW,说明联合修复处理较菌株DNS10单一修复处理在缓解阿特拉津胁迫对大豆幼苗所产生的应激反应方面具有更好的效果。此外,通过考察各处理土壤中阿特拉津消减规律发现,菌株菌株DNS10与菌株P1复合接菌处理对土壤中阿特拉津去除效果好于菌株DNS10单一接种处理,在修复处理的18d时土壤中阿特拉津降解率可达到92.09±1.74%。(5)采用RNA-Seq测序技术,研究阿特拉津胁迫下大豆幼苗的响应机理以及降解菌DNS10与解磷菌P1联合修复与菌株DNS10单一修复对阿特拉津胁迫下大豆幼苗关键基因转录差异情况。结果发现,受阿特拉津胁迫作用影响的大豆幼苗相关的代谢通路主要包括:光合作用、光合作用天线蛋白、次生代谢产物的生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、卟啉与叶绿素代谢、光合生物的固碳作用等通路。复合接种(DNS10+P1)与单接种DNS10相比能上调大豆幼苗中参与磷脂酰肌醇信号系统通路的磷脂酰肌醇磷脂酶C,γ-1、肌醇-1,3,4-三磷酸5/6-激酶/肌醇-四磷酸-1-激酶、钙调素等基因。联合修复阿特拉津胁迫下大豆幼苗能够下调参与脂肪酸降解通路的基因来提高大豆品质,上调参与油菜素类固醇生物合成通路中的2,2-α-羟化酶基因和参与碱基切除修复通路中DNA-3-甲基腺嘌呤糖基酶Ⅰ基因来提高大豆幼苗的抗逆性。
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