论文部分内容阅读
研究背景： 生物力学是人体生命活动中的一个重要方面。生命的新陈代谢除了包含生物化学的各种反应外，还涉及大量的生物力学因素。人体内各种组织具有不同的刚度，随着人体生理过程以及病理生理过程的变化，组织的刚度也发生着变化。刚度小的组织易发生变形而刚度大的组织不易发生变形。细胞外基质的这种力学性质很大程度上影响着其中细胞的生物学行为。细胞会受其细胞外基质刚度变化影响的特点可为疾病的诊断如癌症等提供重要的线索。本实验模拟胃组织的刚度变化来观察探索其对人胃黏膜上皮细胞GES-1的影响。 目的： 实验观察基底刚度对人胃黏膜上皮细胞GES-1增殖率的作用，并对细胞刚度及形态的变化进行微尺度表征。 材料与方法： 1.水凝胶基底制备及表征 根据文献，制作模拟相应组织刚度的聚丙烯酰胺水凝胶基底，并用修饰有玻璃微球的AFM探针实际测量各刚度水凝胶基底的杨氏模量。 2.不同刚度基底上GES-1细胞增殖率检测 把人胃黏膜上皮细胞GES-1培养在各刚度基底上，在选定的时间点(12h、24h、48h、72h)用CCK-8试剂盒测量各刚度基底上GES-1细胞的OD值，通过单因素力差分析方法比较各自的细胞增殖率。 3.不同刚度基底上GES-1细胞微区力学表征 用修饰有玻璃微球的AFM探针测量48小时各刚度基底上GES-1细胞的周边区及核区的杨氏模量，通过两独立样本的t检验方法比较细胞周边区及核区的差异性。 4.不同刚度基底上GES-1细胞骨架表征 罗丹明标记的鬼笔环肽染色48小时各刚度基底上GES-1细胞的微丝骨架，DAPI染色细胞核，用倒置荧光显微镜成像GES-1细胞应力纤维的表现。 5.不同刚度基底上GES-1细胞形貌微尺度表征 用环境扫描电镜成像48小时各刚度基底上GES-1细胞的形貌。描述GES-1细胞的铺展以及片状伪足、丝状伪足的情况。用原子力显微镜成像活体GES-1细胞48小时在各刚度基底上的表现。 结果： 1.水凝胶基底制备及表征 刚度梯度选择为:1.10±0.34kPa为最小刚度，10.61kPa模拟胃组织刚度，40.40±2.39kPa模拟胃癌组织刚度，盖玻片为最大刚度。制备的水凝胶刚度实测值对应为:0.84±0.22kPa，9.71±1.19kPa，39.22±3.19kPa。 2.不同刚度基底上GES-1细胞增殖率检测 在第12小时，GES-1细胞的OD值随着其基底刚度的增大而增大，且各组的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。在第24小时，9.71kPa组与39.22kPa组的OD值统计学差异消失(P＞0.05)。在第48小时，39.22kPa组与玻璃组及9.71kPa组均没有统计学差异(P＞0.05)，但9.71kPa组与玻璃组的统计学差异出现(P＜0.05)。在第72小时，39.22kPa组与9.71组的统计学差异出现(P＜0.05)。 3.不同刚度基底上GES-1细胞微区力学表征 在第48小时，0.84kPa组及9.71kPa组的GES-1细胞的周边区及其核区的杨氏模量均没有统计学差异(P＞0.05)。39.35kPa组及玻璃组的GES-1细胞的周边区及其核区的杨氏模量均具有统计学差异(P＜0.05)，且GES-1细胞的周边区的杨氏模量均大于核区的杨氏模量。此外，玻璃组GES-1细胞周边区的杨氏模量大于39.35kPa组GES-1细胞周边区的杨氏模量，且具有统计学差异(P＜0.05)。 4.不同刚度基底上GES-1细胞骨架表征 在第48小时，0.84kPa组的GES-1细胞的应力纤维不明显。玻璃组GES-1细胞的应力纤维最明显。39.35kPa组的GES-1细胞的应力纤维较9.71kPa组的明显。应力纤维较多地分布在细胞的周边区。 5.不同刚度基底上GES-1细胞形貌微尺度表征 在第48小时，经环境扫描电镜成像发现:0.84kPa组的GES-1细胞没有铺展开，细胞周边区可见少量丝状伪足。玻璃组的GES-1细胞完全铺展开，细胞周边区出现明显的片状伪足及其前端的丝状伪足。39.22组的GES-1细胞的铺展面积大于9.71kPa组。39.22kPa主要表现为片状伪足，而9.71kPa组主要表现为丝状伪足。原子力显微镜对各刚度组活体的GES-1细胞的成像结果与环境扫描电镜相同。 结论： 1.人胃黏膜上皮细胞GES-1的增殖率受其基底刚度的影响。随着基底刚度的增加，人胃黏膜上皮细胞GES-1的增殖率增加。 2.人胃黏膜上皮细胞GES-1增殖的生物学行为是GES-1细胞与基底相互作用产生的。刚度较小的基底易发生变形，人胃黏膜上皮细胞GES-1铺展不开，应力纤维、丝状伪足及片状伪足均不明显。基底刚度增加会促进人胃黏膜上皮细胞GES-1的铺展，较多丝状伪足及片状伪足产生，细胞周边区应力纤维分布增加以及细胞周边区杨氏模量增加。