铁硫蛋白(Rieske iron sulfur proteiu,RISP)是生物体呼吸链中最重要的电子传递载体之一,是构成呼吸链复合物Ⅲ关键亚基的主要蛋白。抑制RISP,将可能切断呼吸链,降低生物体内ATP水平,使目标害虫因缺乏ATP而死亡。深入研究RISP基因及其编码蛋白分子结构,对于设计新型呼吸链抑制剂具有潜在的应用意义。本文以斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)为供试昆虫,克隆了斜纹夜蛾线粒体复合物Ⅲ Fe-S蛋白亚基基因SlitRISP,研究了其不同发育阶段的表达特征,对SlitRISP进行了原核表达,并应用细胞转染和RNAi技术研究了化学合成的siRNA对SlitRISP的干扰效果,旨在为研制作用昆虫呼吸链的新型杀虫剂提供基础。主要研究内容和结果如下。　　 根据GenBank中登录的昆虫RISP基因序列,设计简并引物,采用RT-PCR和RACE方法,从斜纹夜蛾6龄幼虫克隆获得SlitRISP全长序列(GenBank登录号HQ599193)。SlitRISP核苷酸序列全长1038bp,其中开放阅读框全长816bp,编码271个氨基酸残基,预测相对分子量29.19kDa,等电点9.02。氨基酸序列与家蚕和小菜蛾的一致性分别为83％和79%。SlitRISP基因组DNA大小为4413 bp,含有3个内含子,分别为95bp、949和2552 bp。　　 运用荧光定量PCR的方法,研究了SlitRISP在斜纹夜蛾生长发育阶段的表达特征。结果表明,SlitRISP在斜纹夜蛾各个发育阶段均有表达,但表达量存在显著差异,其中幼虫龄期和成虫期表达量显著高于卵期和蛹期,表明SlitRISP可能与斜纹夜蛾生理活动密切相关。　　 将该基因重组到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET28a-SlitRISP,并转入原核细胞中表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,SlitRISP能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到约29kD的特异性外源蛋白,与预测的SlitRISP蛋白分子量相吻合。　　 应用RNAi技术研究了化学合成siRNA对斜纹夜蛾细胞系SL-1 SlitRISP的沉默效应。荧光定量PCR测定结果表明,以50、100 nM siRNA干扰处理后24 h、48 h,SlitRISP的mRNA表达量均显著低于CK,ATP含量显著低于CK,细胞增殖受到显著抑制,SL-1细胞线粒体膜电位在处理后24 h降低,在处理后48 h升高。　　 结合研究结果,讨论了SlitRISP的基因结构特征、表达时序性和RNAi效果。本文首次阐明了SIitRISP的基因结构,并从细胞水平上证实了通过化学合成siRNA可以显著干扰SlitRISP功能的发挥,为今后深入研究昆虫RISP功能,研制以其为主要作用靶标的新型杀虫剂提供了基础。