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脑出血(ICH)是一种破坏性的神经系统损伤,具有较高的发病率和死亡率。脑出血后,脑实质内发生一系列复杂的病理生理改变,包括血肿形成,脑水肿,血液释放具有细胞毒性的成分,氧化应激和炎症反应等。这些病理因素共同作用导致神经细胞死亡,并进一步导致神经功能缺损。程序性坏死(Necroptosis)是新近发现的受调控的细胞坏死,可通过肿瘤坏死因子(TNF-α)激活。Necroptosis在TNF-α或Fas刺激下通过激活受体相互作用蛋白1(RIP1),并进一步与受体相互作用蛋白3(RIP3)相互作用形成RIP1-RIP3促坏死复合体。Necrostatin-1(Nec-1),是Necroptosis的特异性小分子抑制剂,可以抑制RIP1激酶活性及RIP1和RIP3的相互作用。有研究表明Necroptosis在神经细胞死亡中发挥重要的作用。谷氨酸毒性在脑缺血中介导神经细胞死亡,并且谷氨酸毒性也参与脑出血后的神经细胞死亡。谷氨酸主要通过受体介导的兴奋性毒性和非受体介导的氧化毒性发挥其毒性作用的。氯化血红素(hemin),氧化形式的血红素,是亲脂性的细胞毒性氧化剂,能够诱导血肿周围神经细胞死亡。细胞实验表明氯化血红素能够在24小时内杀死神经元和星形胶质细胞。但是谷氨酸或氯化血红素的神经细胞毒性作用机制还不是很明确。因此,本课题首要目标是探索RIP1和RIP3通路是否参与谷氨酸或氯化血红素诱导的HT22海马神经细胞死亡,以及研究Nec-1在谷氨酸或氯化血红素诱导的HT22细胞死亡中的神经保护作用。我们在HT22细胞中研究谷氨酸或氯化血红素细胞死亡的机制。结果显示RIP1抑制剂Nec-1可抑制谷氨酸或氯化血红素诱导的HT22细胞死亡,并且减少线粒体的活性氧(ROS)水平。同时,我们发现使用siRNA敲低RIP3表达水平可以显著减少谷氨酸或氯化血红素诱导的HT22细胞死亡。这些数据显示RIP1和RIP3介导谷氨酸或氯化血红素诱导的HT22海马细胞死亡。活性氧参与介导谷氨酸或氯化血红素诱导细胞死亡。但是,Necroptosis在小鼠脑出血中作用尚不清楚。本课题的另一个目标是研究Nec-1在脑出血中是否可以通过抑制Necroptosis减轻脑损伤。我们使用胶原酶诱导小鼠脑出血,使用western blot检测RIP1和RIP3的表达;在血红蛋白诱导的原代神经元损伤中研究Nec-1的保护作用;在脑出血前15分钟侧脑室给予小鼠Nec-1,在相应时间点检测神经功能、脑水肿、脑出血量。我们进一步通过免疫共沉淀、western blot、碘化丙啶标记(PI)、免疫组化和实时定量PCR检测炎症因子表达等方法研究Nec-1的保护机制。结果显示RIP1在出血前后的脑组织中大量表达,RIP3在脑出血后表达明显升高。Nec-1减轻血红蛋白诱导的原代神经元损伤。在小鼠脑出血中,Nec-1可以提高小鼠的神经功能表现并明显减轻脑水肿,但不减少小鼠脑出血量。同时,Nec-1可以抑制RIP1和RIP3的相互作用、减轻细胞坏死,并能够明显抑制小胶质细胞活化和减轻炎性反应。因此,RIP1和RIP3介导的Necroptosis是脑出血后神经细胞死亡的重要途经;Nec-1通过抑制Necroptosis在脑出血中起到减轻脑损伤的作用。综上所述,RIP1和RIP3介导的Necroptosis在谷氨酸、氯化血红素以及血红蛋白诱导的神经元死亡以及小鼠脑出血后神经细胞损伤及神经功能缺损中起关键作用。Necrostatin-1在体内和体外通过抑制RIP1-RIP3通路而起到多重神经保护作用。RIP1和RIP3可能是脑出血干预的新靶点,而Nec-1有望成为脑出血治疗的新手段。