论文部分内容阅读
目的：股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head, ONFH）是骨科常见病，创伤性ONFH主要见于髋部创伤，而非创伤性ONFH最常见于过量激素和饮酒[1]。目前激素性股骨头坏死已居非创伤性股骨头坏死的首位[2,3]。激素性股骨头坏死(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)的临床治疗进展缓慢，关节致残率极高，严重影响患者的生活质量。因其发病机制还不清楚，迄今尚缺乏有效的防治方法。内毒素可诱导血管的炎性反应且能造成血管内皮损伤，使血液呈血栓前高凝状态，在此基础上应用大量的激素来诱导股骨头发生坏死，此过程与临床上SANFH的发病过程相似［4］。血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1, TSP-1）是第一个被发现的内源性多肽类血管新生抑制剂，TSP-1通过抑制促血管生长因子与其在内皮细胞表面的受体结合而间接抑制血管新生。那么TSP-1在激素性股骨头坏死中的作用机制如何？TSP-1基因敲除后对激素性股骨头坏死的影响还不清楚。本课题拟采用内毒素（LPS）联合激素诱导小鼠股骨头坏死。用TSP-1基因敲除型（TSP-1KO）小鼠和野生型小鼠为模型，比较TSP-1KO小鼠股骨头坏死的情况。通过此实验来探讨：1.TSP-1基因在激素性股骨头坏死中的表达。2.TSP-1基因对激素性股骨头坏死的影响。3. TSP-1基因对肿瘤坏死因子（TFN-а）、白介素1（IL-1β）表达的影响。方法：取6周龄C57BL/6小鼠20只，随机分为A、B组（n=10）。A组是空白对照组，B组是LPS联合激素（甲泼尼龙琥珀酸钠，甲强龙）组，C组是TSP-1KO组（n=6）。B、C组小鼠每只按50ug/kg剂量腹腔注射内毒素（LPS），每天1次,连续2天。第3天按20mg/kg剂量开始腹腔注射甲强龙，每天1次，连续3天。A组于同时间点腹腔注射等量生理盐水。于第1次注射LPS后3周时处死A、B组小鼠各4只，观察模型是否成功建立。取股骨头和肝脏组织苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining HE）、免疫组织化学染色（immunohistochemistry,IHC）进行观察。取肝脏组织提取mRNA进行PCR，检测TSP-1基因的表达。6周时处死A、B、C组全部小鼠，取股骨头和肝脏组织HE染色、免疫组织化学染色进行观察，取三组小鼠肝脏组织提取mRNA进行PCR，检测TNF-α、IL-1β的表达。采用SPSS17.0软件对实验结果进行分析。数据用平均数±标准差表示，组间数据比较用单因素方差分析，P＜0.01为有显著差异，具有统计学意义；P＜0.05为有差异，具有统计学意义； P＞0.05为无显著差异，无统计学意义。结果：3周时A、B组小鼠HE染色观察：A组肝脏正常，肝脏组织结构清晰；股骨头骨小梁完整，排列规则，骨细胞清晰可见，髓间脂肪细胞相对较少，形态正常。B组肝细胞肿胀，细胞内可见小脂肪空泡，肝索结构不清；股骨头骨小梁较正常变细，部分断裂，部分骨细胞边聚、固缩，髓间脂肪细胞直径增大，数目增多；免疫组织化学观察：A组骨保护素(osteoprotegerin,OPG)棕黄色颗粒多见、骨保护素配体(osteoprotegerin ligand, OPGL)棕黄色颗粒较少，阳性染色率无明显改变。B组骨保护素(osteoprotegerin OPG)阳性表达棕黄色颗粒偶见，OPGL阳性表达棕黄色颗粒较多。两组肝脏提mRNA进行PCR检测发现B组TSP-1基因表达明显高于A组（P值＜0.05）。6周时处死A、B、C组全部小鼠， HE染色观察：A组肝脏正常，肝脏组织结构清晰；股骨头骨小梁完整，排列规则，骨细胞清晰可见，髓间脂肪细胞相对较少，形态正常。B组肝细胞可见不均匀脂肪空泡，肝组织结构模糊。股骨头骨小梁稀疏，断裂增加，骨细胞坏死空骨陷窝增多，髓间脂肪细胞多见。C组肝脏及股骨头较A组变化不明显。B组空骨陷窝明显多于A、C组(P <0.01)，A、C无显著差异（P>0.05）。免疫组织化学观察：A组3周和6周骨保护素(osteoprotegerin,OPG)棕黄色颗粒多见、骨保护素配体(osteoprotegerin ligand, OPGL)棕黄色颗粒较少，阳性染色率无明显改变；B组OPG阳性率6周较3周时降低， OPGL阳性率6周较3周时增高。C组OPG棕黄色颗粒多见、OPGL棕黄色颗粒较少。C组OPG阳性率表达较A组稍降低，OPGL阳性率表达较A组稍增高。 B组与A、C组比较，股骨头OPG局部阳性率表达明显下降，OPGL局部阳性率表达明显上升，有明显差异（P<0.01）。A、C组间OPG局部阳性率表达稍降低，OPGL局部阳性率表达稍增高，无显著差异（P＞0.05）。3组肝脏提取mRNA进行PCR检测TNF-а、IL-1基因表达。B、C组均高于A组（P<0.05）， C组低于B组（P<0.05）。结论：1.激素性股骨头坏死小鼠肝脏组织TSP-1基因表达明显高于正常小鼠， TSP-1基因表达增高与股骨头缺血坏死成正相关。2. TSP-1KO，抑制了激素性股骨头坏死的发生发展。3. TSP-1KO降低了促炎因子（TNF-а、IL-1β）的表达。综上所述：TSP-1KO可改善股骨头血供，减轻缺血改变，促进骨代谢、降低促炎因子（TNF-а、IL-1β）的表达等作用从而防止激素性股骨头坏死的发生。预期可通过抑制体内TSP-1基因的表达来拮抗激素对股骨头内骨细胞的影响，从而起到预防早期激素性股骨头坏死的作用。