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本文以NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸,asparagines-glycine-arginine)肽为靶向因子,构建NGR肽修饰的靶向载基因自组装纳米粒。NGR肽可靶向肿瘤新生血管上皮细胞特异过量表达的CD13受体,因此,我们构建的这一新型载基因自组装纳米粒能够主动靶向到肿瘤新生血管,实现靶向传送目的基因,实现抗肿瘤血管生成基因治疗的目的。
除主动靶向功能外,理想的基因载体应具备高的基因装载率,低毒,控制基因释放等功能。以聚乳酸-聚乙二醇PLA-PEG为载体材料,以增强型绿色荧光蛋白质粒基因(pEGFP)作为报告基因,以自主合成新型阳离子类脂十二烷酸6-(2,6-二氨基-己酰氧基)己酯(6-lauroxyhexyllysinate,LHLN)作为电荷调节剂,采用自组装技术制备高装载率荷基因纳米粒,并在此基础上,进行NGR肽修饰,以探索理想的非病毒基因载体的构建方法。实验所选基因载体材料均生物相容；PEG可增加载体材料亲水性和柔顺性,提高DNA装载率,同时避免网状内皮系统吞噬,延长体内循环时间；纳米粒表面连接NGR肽,特异结合肿瘤新生血管上皮细胞过度表达的CD13受体,从而起到主动靶向和增强基因转染效率的作用。通过研究NGR-CD13靶向结合及其介导的纳米粒内在化过程,探索外源基因靶向进入细胞的机制；在基因靶向治疗纳米载体及其靶向机制研究上取得一定进展,为肿瘤的抗血管生成基因治疗奠定实验基础及理论依据。课题主要研究方法与结果如下:
1LHLN修饰阳离子PLA-PEG载基因纳米粒的研究在两亲性嵌段共聚物纳米粒处方中引入阳离子类脂作为电荷调节剂来制备阳离子纳米粒是促进非病毒基因载体基因转染的主要手段。鉴于常用的单链阳离子类脂如CTAB和CPC具有较高的细胞毒性,本文利用本实验室自行合成的新型单链阳离子类脂LHLN并用于载基因PLA-PEG纳米粒的修饰,研究新型阳离子类脂LHLN修饰后促进基因转染的效果。
采用改良溶剂扩散法,以LHLN为电荷调节剂制备阳离子型PLA-PEG纳米粒,与报告基因pEGFP复合后得到载基因PLA-PEG纳米粒(PLA-PEGNPs/pDNA),分别对其相关理化性质,细胞毒性,体外释放特性,抗核酸酶降解的能力以及血浆稳定性进行考察。通过体外基因转染实验对复合物在HeLa细胞,A549细胞,HepG2细胞中的转染效率进行初步评价。所制备的新型空白PLA-PEG纳米粒和PLA-PEGNPs/pDNA复合物均呈球形或类球形,平均粒径分别为122.3±5.3nm和164.2±2.5nm；粒径多分散指数分别为0.223和0.288；Zeta电位分别为+24.0±6.8mV和+11.9±2.9mV。所制备的PLA-PEGNPs/pDNA结合紧密,具有较强的抗核酸酶能力。体外释放药物达20天,前期突释过程很明显,48h内累计释放量达80.8％。24h至20d,释药过程非常缓慢,至20d时,累计释放量达到94.6％,认为基本释放完全。释放行为符合双向动力学方程:100-Q=90.22e-0.0735+22.04e-0.0034(ra=0.9822,rb=0.9796)。体外细胞实验表明,在转染剂量下,与CTABPLA-PEGNPs/pDNA以及Lipofectamine相比,PLA-PEGNPs/pDNAs具有较低的细胞毒性(p<0.05)。转染实验结果表明,PLA-PEGNPs/pDNAs具有较高的转染效率,在试验的各种细胞中转染效率均具有PLA-PEGNPs/pDNA>Lipofectamine>CTABPLA-PEGNPs/pDNA>裸DNA的趋势。因此,LHLN是一种应用前景广泛,毒性小,体外转染效率高的新型阳离子类脂,可用于促进纳米粒的体外基因转染效率。用其修饰的PLA-PEGNPs/pDNA,制备工艺简单,毒性低,转染效率高,具有一定开发前景。
2NGR靶向阳离子型PLA-PEG纳米粒的研究抗肿瘤血管生成基因治疗是一种很有效的抗血管生成方法,采用基因转导系统将治疗基因运送到新生血管内皮细胞并使其高效表达,以自分泌和旁分泌的形式抑制肿瘤血管生成,可在肿瘤局部达到稳定长效的作用。近年来研究表明,含NGR序列的小肽可特异靶向肿瘤血管上皮细胞CD13受体,并且环状NGR肽比线性NGR肽更具优势。
本文设计和合成了具有血管内皮细胞靶向功能的环六肽CNGRCG(cNGR),并以其为靶向因子与载体材料PLA-PEG耦合(cNGR-PLA-PEG),制备cNGR修饰PLA-PEG纳米粒(cNGR-PLA-PEGNPs)。静电复合绿色荧光蛋白基因为报告基因制备载基因纳米粒。分别对其相关理化性质,体外释放特性,抗核酸酶降解的能力以及血浆稳定性进行考察。与普通PLA-PEG纳米粒(PLA-PEGNPs)对比,通过体外细胞毒性试验和基因转染实验对复合物在HUVEC细胞,A549细胞,HepG2细胞中的细胞毒性和转染效率进行初步评价。
结果,通过EDC/NHS法合成得到cNGR-PLA-PEG,核磁共振(1HNMR)和红外(IR)验证了其结构正确性。所制备cNGR-PLA-PEGNPs和cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA复合物均呈球形或类球形,平均粒径分别为139.5±7.9nm和171.9±3.9nm；粒径多分散指数分别0.290和0.167；Zeta电位分别为+22.14±1.88mV和+10.7±4.5mV。cNGR-PLA-PEGNPs表面cNGR修饰率达9.77±1.32％。所制备的cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA结合紧密,具有较强的抗核酸酶能力和血浆稳定性。体外释放实验结果表明,cNGR-PLA-PEGNPs/DNA释放行为符合双向动力学方程:100-Q=83.93e-0.081t+18.47e-0.004t(ra=0.9899,rb=0.9874)。释药全过程包括快速释放(0-12h)和缓慢释放(24h-20d)两个阶段。前48h突释明显,累计释放量达84.9％。24h至20d,释药过程非常缓慢,至20d时,累计释放量达到98.2％,释放完全。体外细胞实验表明,在转染剂量下,Lipofectamine相比,cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA具有较低的细胞毒性(p<0.05)。转染实验结果表明,在CD13表达阳性细胞中,cNGR-PLA-PEGNPs明显高于在PLA-PEGNPs/pDNA,而在CD13表达阴性HepG2细胞中,cNGR-PLA-PEGNPs的转染效率与PLA-PEGNPs/pDNAs没有显著差异(p>0.05)。因此,cNGR-PLA-PEGNPs具有较高的体外靶向性和转染效率,有望成为一种高效的、能将治疗基因靶向运输到肿瘤新生血管部位的纳米载体。
3NGR介导靶向载基因PLA-PEG纳米粒入胞机制研究本文采用免疫荧光示踪及流式细胞技术对受体介导基因载体的体外靶向性和与细胞相互作用机制进行了初步探讨,以期在阐明机制的基础上为基因载体构建指明方向。
采用掺和荧光标记载体材料的方法分别制备荧光标记的cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs并考察其理化性质。通过免疫荧光技术和流式细胞技术对CD13表达阳性细胞进行筛选。通过倒置荧光显微镜和流式细胞技术评价cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs的体外摄取特征和在不同细胞中入胞机制。结果表明,所制备的荧光标记cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs均呈表面光滑圆整的球形,粒径分别为149.6±8.4nm和136.9±4.5nm,多分散指数为0.247和0.183；纳米粒的Zeta电位分别为+17.2±3.9和+19.54±2.3。荧光材料FITC-PLA-PEG的掺入不对纳米粒的理化性质产生显著影响。因此,可以用荧光标记纳米粒来研究纳米粒本身的特性与功能。细胞表面CD13受体表达量的顺序为:HUVEC>A549>HCT116>HepG2。选择CD13阳性率最高的HUVEC细胞和CD13阴性HepG2细胞用于进一步的研究。纳米粒体外摄取实验结果表明,纳米粒入胞为时间、浓度依赖性过程,并受低温和代谢抑制剂的影响,cNGR-PLA-PEGNPs更容易进入HUVEC细胞。竞争抑制中,游离cNGR与cNGR-PLA-PEGNPs竞争细胞表面CD13受体,抑制细胞对其摄取,表明cNGR-PLA-PEGNPs通过受体介导内吞途径入胞。进一步的内吞抑制剂实验表明,cNGR-PLA-PEGNPs进入HUVEC细胞为笼形蛋白和小窝蛋白介导相结合的机制,但以小窝蛋白介导为主,另外还涉及到少量程度的液相内吞。PLA-PEGNPs进入HUVEC细胞以巨胞饮途径为主,伴有少量程度的笼形蛋白介导途径。cNGR-PLA-PEGNPs进入HepG2细胞以小窝蛋白介导途径为主,伴有少量程度的液相内吞。PLA-PEGNPs进入HepG2细胞主要涉及小窝蛋白介导途径和巨型胞饮途径两种机制,还有少量程度的液相内吞,但以巨型胞饮途径为主。由此可见,纳米粒类型和细胞类型均对纳米粒的入胞途径有着重要的影响。
综上所述,本文制备的NGR介导靶向载基因PLA-PEG纳米粒对DNA保护作用强,所载DNA能够从载体中缓慢释放,细胞耐受性良好,具有较高的体外靶向性和转染效率,其入胞机制涉及笼形蛋白介导和小窝蛋白介导两种途径。在此基础上进一步研究影响基因载体细胞内命运的关键因素,从而对其载体构建进行合理优化,使其成为具有一定开发前景的主动靶向非病毒纳米基因载体。