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目的:1.构建一种由survivin启动子介导的重组载体pc DNA3.1-p Survivin-TK。2.检测由survivin启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)自杀基因的真核表达载体pc DNA3.1-p Survivin-TK在肝癌细胞内是否能够特异性表达。3.研究由survivin启动子介导的HSVtk自杀基因联合更昔洛韦(GCV)对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:1.体外培养HL-7702人正常肝细胞、HEK293T人胚肾细胞、Hep G2及Hu H-7人肝癌细胞。2.提取Hep G2细胞的基因组DNA,PCR扩增survivin启动子序列;构建重组载体pc DNA3.1-p Survivin-TK并进行测序,通过BLAST对DNA序列的同源性进行比对;将该质粒载体转导入大肠杆菌DH5α中,通过菌液PCR扩增HSVtk基因,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。3.用重组质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK分别转染HL-7702、HEK293T、Hep G2及Hu H-7细胞,48小时后提取细胞总RNA及总蛋白,经RT-PCR法及Western blot法检测HSVtk基因在m RNA及蛋白水平的表达情况。4.重组质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK被转染到HL-7702、Hep G2及Hu H-7细胞中,48小时后,加入梯度剂量GCV处理,MTT法检测HSVtk/GCV自杀基因系统对细胞存活率的影响。5.质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK转染HL-7702、Hep G2及Hu H-7细胞后,加入150μg/ml GCV处理24小时,Hoechst 33258染色法检测细胞核形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞内活性氧(ROS)水平;通过Caspase-3染色法在荧光显微镜下观察细胞内活化caspase-3水平。结果:1.通过PCR扩增得到survivin启动子序列,构建由survivin启动子介导的重组质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK,测序得DNA序列与Gen Bank中的HSVtk序列相同,重组质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK成功构建。2.RT-PCR法及Western blot法检测结果表明,HSVtk基因在Hep G2及Hu H-7细胞中表达明显,而在HL-7702、HEK293T细胞中均未见HSVtk基因的表达。3.MTT法检测得知,随着前体药物GCV剂量的升高,Hep G2及Hu H-7细胞存活率逐渐下降,与空白组相比,具有显著统计学差异(P﹤0.05),而HL-7702细胞未见明显杀伤作用。4.通过Hoechst染色法分析,转染质粒pc DNA3.1-p Survivin-TK的Hep G2及Hu H-7细胞在GCV处理后,其细胞核颜色发白呈致密浓染且染色质固缩,而HL-7702细胞的细胞核未见明显改变。5.流式细胞仪检测得知,经HSVtk/GCV自杀基因系统处理的Hep G2及Hu H-7细胞,其细胞凋亡率及细胞内活性氧水平显著升高,与空白组相比差异具有统计学意义(P﹤0.05),而HL-7702细胞凋亡不明显,且活性氧水平也未见明显变化。6.Caspase-3染色法表明,Hep G2和Hu H-7细胞经HSVtk/GCV自杀基因系统干预后,荧光显微镜观察可见大量红色荧光,即caspase-3明显增多,而HL-7702细胞未见明显凋亡。结论:1.成功构建了一种新型的真核表达质粒载体pc DNA3.1-p Survivin-TK。2.HSVtk自杀基因在Hep G2和Hu H-7细胞内成功表达,而在HL-7702、293T细胞内未见表达。3.HSVtk/GCV自杀基因系统对Hep G2和Hu H-7肝癌细胞有特异性的显著杀伤作用,而对HL-7702细胞未见显著杀伤。